衰老的CD8+T細(xì)胞參與心律失常鈣失調(diào)的作用機(jī)制及與房顫發(fā)病率的關(guān)系

本研究旨在揭示 AF 患者的免疫細(xì)胞生理變化，通過隊(duì)列研究闡明特異性免疫細(xì)胞亞群與導(dǎo)管消融術(shù)后 AF 的發(fā)生率和復(fù)發(fā)之間的關(guān)系，并探討其潛在的機(jī)制。

研究方法：
本文采用熒光標(biāo)測技術(shù)（Optical Mapping）來檢測 Control 組和實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)作電位以及鈣瞬變信號(hào)，包括動(dòng)作電位時(shí)程、傳導(dǎo)速度、有效不應(yīng)期以及鈣瞬變交替等指標(biāo)。

研究結(jié)果：
1. AF 中免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特性和異質(zhì)性
為了驗(yàn)證 AF 中免疫細(xì)胞的變化，對(duì)從 AF 患者和非 AF 患者中分離出來的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA-seq）分析。在進(jìn)行整合和可視化后，得到 6 個(gè)亞群：B 細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞和其他 T 細(xì)胞。然后，對(duì)每個(gè)亞群子集中前 50 個(gè)差異表達(dá)基因 (DEGs)  進(jìn)行基因本體論（GO）富集分析。通過比較分析發(fā)現(xiàn)，AF 患者的亞群比例和基因的表達(dá)水平發(fā)生了一些變化。值得注意的是，CD4+ T細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞的比例變化是最顯著的。因此，提取這兩個(gè)子集進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
 

圖1. AF 中免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特性和異質(zhì)性
 

2. AF 相關(guān)細(xì)胞亞群的識(shí)別和特征
基于不同的基因表達(dá)模式，CD4+ T 細(xì)胞和CD8+ T 細(xì)胞被進(jìn)一步分為 20 個(gè)亞群，而在 AF 中有一個(gè)明顯的異質(zhì)性亞群，其中大部分為效應(yīng)記憶 CD8+ T 細(xì)胞。此外，AF 組中 CD8+ T 細(xì)胞數(shù)量增加。GO 富集分析顯示，AF 的特征基因集在 AF 進(jìn)展中發(fā)揮的作用相似。通過構(gòu)建所有 CD8+ T 細(xì)胞的偽時(shí)間軌跡，鑒定出 AF 相關(guān)亞群都位于該軌跡的末端，表明這些細(xì)胞是衰老的 CD8+ T 細(xì)胞。與此分析一致的是，這些細(xì)胞中免疫細(xì)胞衰老的標(biāo)志基因 CD57（B3GAT1）和 KLRG1 表達(dá)上調(diào)，而 CD27 或 CD28 的表達(dá)下降。假時(shí)間順序熱圖顯示，大部分上調(diào)的基因與 T 細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。此外，衰老細(xì)胞中各種細(xì)胞毒性、趨化性和炎癥相關(guān)因子的表達(dá)均上調(diào)。綜上所述，提示衰老的 CD8+ T 細(xì)胞可能促進(jìn) AF 的發(fā)展。

圖2. AF 相關(guān)免疫細(xì)胞亞群的鑒定
 

 

3. 衰老的 CD8+ T 細(xì)胞與房顫發(fā)病率之間的關(guān)系
為了進(jìn)一步驗(yàn)證衰老的 CD8+ T 細(xì)胞與 AF 發(fā)病率之間的關(guān)系，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測得到房顫患者的衰老 CD8+ T 細(xì)胞數(shù)量顯著增加，這一結(jié)果與 scRNA-seq 檢測結(jié)果一致。

圖4. 衰老的 CD8+ T 細(xì)胞與 AF 發(fā)病率相關(guān)

4. 衰老 CD8+ T 細(xì)胞與 AF 預(yù)后的關(guān)系
在本研究中，26.8% 的患者在術(shù)后 10 個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)房顫復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)性房顫患者的外周血和左心房血中衰老的CD8+ T 細(xì)胞數(shù)量顯著增加。此外，Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示，衰老 CD8+ T 細(xì)胞百分比的升高是預(yù)測 AF 復(fù)發(fā)的關(guān)鍵指標(biāo)。

圖5. 衰老的 CD8+ T 細(xì)胞與 AF 的預(yù)后相關(guān)
 

5. 衰老的 CD8+ T 細(xì)胞在 AF 中顯示出 IFN-γ 的產(chǎn)生增加
為了了解衰老細(xì)胞的基本病理特征，構(gòu)建了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn) IFN-γ 為衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的主要組成成分�；�因集富集分析（GSEA）結(jié)果表明 IFN-γ 相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)顯著上調(diào)。這些結(jié)果證明，IFN-γ 表達(dá)增加是 AF患者衰老 CD8+ T 細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌譜中最重要的改變。

6. IFN-γ 增加可誘導(dǎo) Ca²⁺ 處理異常，并增強(qiáng)房顫易感性通過免疫熒光檢測和 scRNA-seq 分析發(fā)現(xiàn) AF 患者有更多的衰老 CD8⁺ T 細(xì)胞出現(xiàn)纖維化。當(dāng)將 hiPSC-AMs 暴露于培養(yǎng)的衰老 CD8⁺ T 細(xì)胞上清液時(shí)，Ca²⁺ 火花的頻率明顯增加，而應(yīng)用IFN-γ 中和抗體可以有效地降低火花的頻率。這提示，IFN-γ 誘導(dǎo)衰老 CD8⁺ T 細(xì)胞的 Ca²⁺ 失調(diào)。為了進(jìn)一步闡明 IFN-γ 在房顫易感性中的潛在作用，我們對(duì)大鼠的心臟進(jìn)行了熒光標(biāo)測。雖然 IFN-γ 灌注沒有顯著改變心房有效不應(yīng)期（AERP）和動(dòng)作電位時(shí)程（APD），但它導(dǎo)致了傳導(dǎo)速度的降低。此外，IFN-γ 灌注后出現(xiàn)了電交替和鈣瞬變交替等典型的心律失�，F(xiàn)象，同時(shí)使 AF 的誘發(fā)率增加且持續(xù)時(shí)間延長。