大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

一、引言
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為一種具有多向分化潛能和自我更新能力的成體干細(xì)胞，在組織工程、再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。大鼠是常用的實(shí)驗(yàn)動物模型，其 BMSCs 的研究對于人類相關(guān)疾病和治療策略的探索具有重要的參考價(jià)值。綠色熒光蛋白（GFP）作為一種廣泛應(yīng)用的報(bào)告基因，能夠在不影響細(xì)胞生理功能的情況下，實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可視化追蹤。因此，成功將 GFP 基因轉(zhuǎn)染至大鼠 BMSCs 對于深入研究 BMSCs 在體內(nèi)的分布、遷移、分化等生物學(xué)過程至關(guān)重要。然而，BMSCs 具有獨(dú)特的細(xì)胞特性，其轉(zhuǎn)染過程面臨著諸多挑戰(zhàn)，如轉(zhuǎn)染效率低、細(xì)胞毒性等問題。本研究旨在探索優(yōu)化的大鼠 BMSCs GFP 轉(zhuǎn)染方案，為相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

二、材料與方法
（一）實(shí)驗(yàn)動物
選取健康的成年 SD 大鼠（體重 200 - 250g），雌雄不限。所有大鼠均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)的動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，保持適宜的溫度、濕度和光照周期，自由飲水和進(jìn)食。
（二）大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
骨髓采集
通過頸椎脫臼法處死大鼠，在無菌條件下分離股骨和脛骨。用含有肝素（100 U/mL）的 PBS 沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液。
細(xì)胞分離與培養(yǎng)
將骨髓細(xì)胞懸液緩慢加入到密度為 1.073 g/mL 的淋巴細(xì)胞分離液上，進(jìn)行密度梯度離心（2000 rpm，20 分鐘）。吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，用 PBS 洗滌兩次（1000 rpm，5 分鐘）。然后，將細(xì)胞重懸于含有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 - 鏈霉素的低糖 DMEM 培養(yǎng)基中，接種于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 小時(shí)后首次換液，去除未貼壁的細(xì)胞，以后每 3 - 4 天更換一次培養(yǎng)基。
（三）綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
轉(zhuǎn)染試劑及載體
選用了兩種常見的轉(zhuǎn)染試劑，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 和聚乙烯亞胺（PEI），以及攜帶綠色熒光蛋白基因（GFP）的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體在使用前需進(jìn)行大量提取和純化，確保其質(zhì)量和純度符合轉(zhuǎn)染要求。
轉(zhuǎn)染前細(xì)胞準(zhǔn)備
當(dāng) BMSCs 生長至 70 - 80% 匯合度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種于 6 孔板或 24 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量根據(jù)板的規(guī)格進(jìn)行調(diào)整，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度適宜。同時(shí)，更換新鮮的培養(yǎng)基，確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染方法
按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。首先，將適量的質(zhì)粒 DNA（根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置不同的量，范圍從 0.5 - 2μg）稀釋于無血清的 Opti - MEM 培養(yǎng)基中，輕輕混勻。然后，將 Lipofectamine 2000 試劑在另一管 Opti - MEM 培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育 5 分鐘。之后，將稀釋后的 DNA 溶液與 Lipofectamine 2000 溶液輕輕混合，室溫孵育 20 分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。最后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。將培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
聚乙烯亞胺（PEI）轉(zhuǎn)染方法
對于 PEI 轉(zhuǎn)染，將 PEI 與質(zhì)粒 DNA 按照不同的質(zhì)量比（N/P 比，范圍從 5 - 20）進(jìn)行混合。先將質(zhì)粒 DNA 稀釋于適量的 PBS 中，然后將 PEI 溶液緩慢加入到 DNA 溶液中，輕輕混勻，室溫孵育 15 - 30 分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，操作過程與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染類似。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞同樣置于 37℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（四）轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性檢測
熒光顯微鏡觀察
在轉(zhuǎn)染后 24、48 和 72 小時(shí)，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的 GFP 表達(dá)情況。隨機(jī)選取多個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中 GFP 陽性細(xì)胞的比例，以此評估轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，初步判斷轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的影響。
流式細(xì)胞術(shù)分析
收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并制成單細(xì)胞懸液。通過流式細(xì)胞儀檢測 GFP 陽性細(xì)胞的比例，進(jìn)一步精確評估轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，檢測細(xì)胞的活性指標(biāo)，如細(xì)胞凋亡率等，以評估轉(zhuǎn)染試劑和過程對細(xì)胞的毒性作用。
細(xì)胞增殖能力檢測
采用 CCK - 8 法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72 小時(shí)等），向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入 CCK - 8 試劑，按照試劑盒的說明書操作，在酶標(biāo)儀上測定吸光度值（OD 值）。根據(jù) OD 值繪制細(xì)胞增殖曲線，分析轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖的影響。

三、結(jié)果
（一）大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
經(jīng)過密度梯度離心和培養(yǎng)，成功從大鼠骨髓中分離出 BMSCs。原代培養(yǎng)的 BMSCs 在接種 24 小時(shí)后開始貼壁，呈梭形或多角形。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸增殖并形成集落。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)保持穩(wěn)定，生長狀態(tài)良好。通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示培養(yǎng)的 BMSCs 高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物 CD29、CD44 和 CD90，低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物 CD34 和 CD45，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為 BMSCs。
（二）不同轉(zhuǎn)染試劑和條件下的轉(zhuǎn)染效率
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000
在不同的 DNA 量條件下，轉(zhuǎn)染效率有所不同。當(dāng) DNA 量為 1μg 時(shí)，轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)，熒光顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞表達(dá) GFP，轉(zhuǎn)染效率約為 20%；48 小時(shí)后，轉(zhuǎn)染效率有所提高，達(dá)到約 35%；72 小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)染效率可達(dá) 40% 左右。通過流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果與熒光顯微鏡觀察基本一致，且在該轉(zhuǎn)染條件下，細(xì)胞凋亡率較低，細(xì)胞形態(tài)和增殖能力在轉(zhuǎn)染后短時(shí)間內(nèi)未受到明顯影響。
聚乙烯亞胺（PEI）
不同 N/P 比下，PEI 的轉(zhuǎn)染效率存在差異。當(dāng) N/P 比為 10 時(shí)，轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)轉(zhuǎn)染效率約為 15%，48 小時(shí)后提高到約 30%，72 小時(shí)可達(dá)約 38%。隨著 N/P 比的增加，轉(zhuǎn)染效率有一定提高，但細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)增加。在 N/P 比為 20 時(shí)，雖然轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到約 45%，但細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制。
（三）細(xì)胞活性檢測結(jié)果
流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡率在轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)約為 5%，48 小時(shí)約為 8%，72 小時(shí)約為 10%。而 PEI 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在不同 N/P 比下凋亡率不同，N/P 比為 10 時(shí)，24 小時(shí)凋亡率約為 8%，48 小時(shí)約為 12%，72 小時(shí)約為 15%；N/P 比為 20 時(shí)，24 小時(shí)凋亡率可達(dá)約 15%，48 小時(shí)約為 20%，72 小時(shí)約為 25%。
CCK - 8 法檢測細(xì)胞增殖
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)內(nèi)增殖能力與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比無明顯差異，但在 72 小時(shí)時(shí)增殖速度略有減慢。PEI 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在 N/P 比為 10 時(shí)，48 小時(shí)后增殖能力開始受到一定影響，而在 N/P 比為 20 時(shí)，細(xì)胞增殖在轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)就明顯受到抑制。

四、討論
（一）大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化
在本研究中，通過密度梯度離心法成功從大鼠骨髓中分離出 BMSCs，并在適宜的培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的選擇、血清濃度以及培養(yǎng)環(huán)境等因素對于 BMSCs 的生長和增殖至關(guān)重要。低糖 DMEM 培養(yǎng)基和 10% FBS 的組合能夠滿足 BMSCs 的營養(yǎng)需求，同時(shí)減少細(xì)胞分化的可能性。此外，首次換液時(shí)間的選擇也會影響細(xì)胞的純度和生長狀態(tài)，本研究在 24 小時(shí)后換液有效地去除了未貼壁的血細(xì)胞等雜質(zhì)。
（二）轉(zhuǎn)染試劑和條件對轉(zhuǎn)染效率的影響
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000
Lipofectamine 2000 作為一種常用的轉(zhuǎn)染試劑，在本研究中表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性。其轉(zhuǎn)染效率隨著時(shí)間的延長而提高，這可能是由于隨著時(shí)間推移，更多的質(zhì)粒 DNA 進(jìn)入細(xì)胞核并實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)。合適的 DNA 量對于轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性的平衡至關(guān)重要，本研究中 1μg 的 DNA 量在保證一定轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，對細(xì)胞的損傷較小。
聚乙烯亞胺（PEI）
PEI 的轉(zhuǎn)染效率與 N/P 比密切相關(guān)。在一定范圍內(nèi)，隨著 N/P 比的增加，轉(zhuǎn)染效率提高，但同時(shí)細(xì)胞毒性也增加。這是因?yàn)楦?N/P 比下，PEI 與 DNA 形成的復(fù)合物可能會對細(xì)胞產(chǎn)生更大的物理和化學(xué)刺激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加和增殖能力下降。因此，在使用 PEI 轉(zhuǎn)染時(shí)，需要綜合考慮轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性，選擇合適的 N/P 比。
（三）轉(zhuǎn)染對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
轉(zhuǎn)染過程不僅影響轉(zhuǎn)染效率，還會對細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，如細(xì)胞凋亡和增殖。本研究結(jié)果表明，不同的轉(zhuǎn)染試劑和條件對細(xì)胞凋亡和增殖的影響不同。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 對細(xì)胞的影響相對較小，而 PEI 在高 N/P 比時(shí)對細(xì)胞的損傷較為明顯。這提示我們在進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要全面評估轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的影響，以確保轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能夠保持其生物學(xué)功能，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

五、結(jié)論
本研究成功建立了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系，并對其進(jìn)行了綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。通過比較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 和聚乙烯亞胺（PEI）在不同條件下的轉(zhuǎn)染效率和對細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn) Lipofectamine 2000 在較低的 DNA 量下能夠獲得較好的轉(zhuǎn)染效率且對細(xì)胞毒性較小，而 PEI 在合適的 N/P 比下也可實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)染效率，但需要注意其細(xì)胞毒性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步利用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞追蹤、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持，同時(shí)也為優(yōu)化 BMSCs 轉(zhuǎn)染方案提供了參考。在未來的研究中，可以進(jìn)一步探索新的轉(zhuǎn)染技術(shù)和方法，以提高轉(zhuǎn)染效率和降低細(xì)胞毒性，更好地發(fā)揮 BMSCs 在生物醫(yī)學(xué)研究中的作用。