整合素β1對(duì)人表皮干細(xì)胞增殖分化的作用

一、引言
皮膚作為人體最大的器官，其穩(wěn)態(tài)維持和損傷修復(fù)依賴于表皮干細(xì)胞的正常功能。表皮干細(xì)胞具有自我更新和分化為各種表皮細(xì)胞類型的能力，在維持皮膚的屏障功能和再生過程中起著核心作用。整合素是一類廣泛存在于細(xì)胞表面的跨膜受體，它們參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間的相互作用，在細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和分化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，整合素 β1 在表皮干細(xì)胞中高度表達(dá)，然而其在人表皮干細(xì)胞增殖分化中的精確作用機(jī)制尚未完全闡明。
理解整合素 β1 的功能對(duì)于深入了解表皮干細(xì)胞的生物學(xué)行為以及皮膚的生理和病理過程至關(guān)重要。在皮膚損傷修復(fù)過程中，表皮干細(xì)胞需要精確地調(diào)控其增殖和分化，以確保新生成的表皮組織在結(jié)構(gòu)和功能上的完整性。而整合素 β1 可能通過與特定的 ECM 成分相互作用，激活或抑制一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，從而影響表皮干細(xì)胞的增殖和分化平衡。此外，在一些皮膚疾病如慢性潰瘍、燒傷后的瘢痕形成等過程中，表皮干細(xì)胞的功能失調(diào)可能與整合素 β1 的異常表達(dá)或功能障礙有關(guān)。因此，本研究聚焦于整合素 β1 對(duì)人表皮干細(xì)胞增殖分化的作用，具有重要的理論和臨床意義。

二、材料與方法
（一）細(xì)胞來源與培養(yǎng)
細(xì)胞獲取
人表皮干細(xì)胞來源于健康成人皮膚組織（經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意）。通過酶消化法和機(jī)械分離法相結(jié)合的方式獲取表皮細(xì)胞懸液。具體步驟如下：首先，將皮膚組織剪成小塊，用含中性蛋白酶（dispase）的溶液在 4℃下消化過夜，使表皮與真皮分離。然后，將分離的表皮層進(jìn)一步用胰蛋白酶消化，獲得單細(xì)胞懸液。
細(xì)胞分選
利用表皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物（如整合素 α6、角蛋白 19 等），通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)分離純化表皮干細(xì)胞。將細(xì)胞懸液與針對(duì)這些標(biāo)志物的熒光標(biāo)記抗體孵育，然后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分選，收集高表達(dá)標(biāo)志物的細(xì)胞群作為表皮干細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞培養(yǎng)
將分選得到的表皮干細(xì)胞接種于經(jīng)特殊處理的培養(yǎng)皿（預(yù)先用細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、層粘連蛋白等包被）中，培養(yǎng)于含低濃度胎牛血清（2% - 5%）、表皮生長因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等生長因子的特定培養(yǎng)基（如 K - SFM 培養(yǎng)基）中。培養(yǎng)條件為 37℃、5% CO₂的濕潤環(huán)境。
（二）整合素 β1 表達(dá)的調(diào)控
基因沉默
采用小干擾 RNA（siRNA）技術(shù)來下調(diào)整合素 β1 的表達(dá)。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)整合素 β1 基因的特異性 siRNA 序列，將其轉(zhuǎn)染至表皮干細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染過程使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書的操作步驟進(jìn)行。具體而言，將 siRNA 與脂質(zhì)體在無血清培養(yǎng)基中混合形成復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng) 24 - 48 小時(shí)后，通過實(shí)時(shí)定量 PCR 和 Western blotting 檢測整合素 β1 的表達(dá)水平，以確定基因沉默效果。
基因過表達(dá)
構(gòu)建含有人整合素 β1 基因的重組質(zhì)粒，使用病毒載體（如慢病毒載體）將其導(dǎo)入表皮干細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因過表達(dá)。首先，將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞系（如 293T 細(xì)胞）中，生產(chǎn)攜帶整合素 β1 基因的病毒顆粒。然后，收集病毒上清液，感染表皮干細(xì)胞。感染后的細(xì)胞通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)整合素 β1 的細(xì)胞株，同樣通過實(shí)時(shí)定量 PCR 和 Western blotting 驗(yàn)證基因過表達(dá)情況。
（三）細(xì)胞增殖能力檢測
CCK - 8 法
將不同處理組（整合素 β1 基因沉默組、過表達(dá)組和對(duì)照組）的表皮干細(xì)胞接種于 96 孔板中，每孔接種一定數(shù)量的細(xì)胞（如 5×10³ 個(gè)細(xì)胞）。在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72 小時(shí)等），向每孔加入 CCK - 8 試劑，繼續(xù)孵育 1 - 2 小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測量吸光度值。根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線，分析不同處理組細(xì)胞的增殖能力變化。
BrdU 摻入實(shí)驗(yàn)
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中加入 BrdU（5 - 溴 - 2′ - 脫氧尿苷），使其終濃度為 10μM。繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時(shí)后，固定細(xì)胞，使用抗 - BrdU 抗體進(jìn)行免疫熒光染色或酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）。通過檢測 BrdU 摻入細(xì)胞 DNA 的量來反映細(xì)胞的增殖活性，BrdU 陽性細(xì)胞比例越高，表明細(xì)胞增殖越活躍。
（四）細(xì)胞分化能力評(píng)估
分化標(biāo)志物檢測
通過實(shí)時(shí)定量 PCR 和 Western blotting 檢測表皮干細(xì)胞分化標(biāo)志物（如角蛋白 10、involucrin 等）的表達(dá)水平。在不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)至特定時(shí)間點(diǎn)（如誘導(dǎo)分化 7 - 14 天）后，收集細(xì)胞提取 RNA 和蛋白，分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和電泳、轉(zhuǎn)膜等操作，使用特異性引物和抗體檢測標(biāo)志物的表達(dá)變化。
免疫熒光染色
將細(xì)胞接種于載玻片上，培養(yǎng)至適當(dāng)階段后，固定細(xì)胞并進(jìn)行免疫熒光染色。使用針對(duì)分化標(biāo)志物的抗體（如角蛋白 10 抗體）與細(xì)胞孵育，然后用熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行顯色。通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中分化標(biāo)志物的表達(dá)和分布情況，以直觀地評(píng)估細(xì)胞的分化狀態(tài)。例如，角蛋白 10 在表皮基底層以上的分化細(xì)胞中表達(dá)，其陽性染色的出現(xiàn)和強(qiáng)度變化可反映表皮干細(xì)胞的分化程度。
（五）信號(hào)通路分析
蛋白磷酸化檢測
利用 Western blotting 技術(shù)檢測與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白（如 Akt、ERK 等）的磷酸化水平。不同處理組的細(xì)胞在特定時(shí)間點(diǎn)收集后，提取蛋白并進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，使用針對(duì)磷酸化蛋白（如 p - Akt、p - ERK）和總蛋白（Akt、ERK）的抗體進(jìn)行檢測。磷酸化蛋白水平的變化可以反映相應(yīng)信號(hào)通路的激活或抑制情況。
信號(hào)通路抑制劑實(shí)驗(yàn)
使用特異性的信號(hào)通路抑制劑（如 PI3K 抑制劑 LY294002、MEK 抑制劑 U0126 等）來進(jìn)一步探究整合素 β1 影響表皮干細(xì)胞增殖分化的信號(hào)機(jī)制。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入抑制劑預(yù)處理一定時(shí)間后，再進(jìn)行整合素 β1 基因操作（沉默或過表達(dá)），然后檢測細(xì)胞增殖、分化相關(guān)指標(biāo)以及信號(hào)蛋白的變化，以確定整合素 β1 作用的信號(hào)通路。

三、結(jié)果
（一）整合素 β1 表達(dá)調(diào)控效果
通過 siRNA 轉(zhuǎn)染，整合素 β1 在表皮干細(xì)胞中的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低，與對(duì)照組相比，抑制率可達(dá) 70% 以上。而通過慢病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)，成功獲得了穩(wěn)定高表達(dá)整合素 β1 的表皮干細(xì)胞株，其蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組提高了約 2 - 3 倍。
（二）細(xì)胞增殖能力變化
CCK - 8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，整合素 β1 基因沉默組的細(xì)胞增殖速度明顯減慢，在 72 小時(shí)培養(yǎng)后，吸光度值較對(duì)照組降低了約 30%。相反，整合素 β1 過表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，吸光度值較對(duì)照組提高了約 25%。
BrdU 摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，整合素 β1 沉默組的 BrdU 陽性細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，而過表達(dá)組則高于對(duì)照組，表明整合素 β1 對(duì)表皮干細(xì)胞增殖具有正向調(diào)節(jié)作用。
（三）細(xì)胞分化能力改變
在分化標(biāo)志物檢測中，整合素 β1 基因沉默組的角蛋白 10 和 involucrin 等分化標(biāo)志物的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化后明顯降低，而整合素 β1 過表達(dá)組這些標(biāo)志物的表達(dá)則提前且增強(qiáng)。
免疫熒光染色結(jié)果顯示，整合素 β1 沉默組細(xì)胞中角蛋白 10 的陽性染色較弱且分布局限，而過表達(dá)組細(xì)胞中角蛋白 10 的陽性染色強(qiáng)度和范圍明顯增加，表明整合素 β1 促進(jìn)表皮干細(xì)胞的分化。
（四）信號(hào)通路分析結(jié)果
Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)，整合素 β1 過表達(dá)可促進(jìn) Akt 和 ERK 蛋白的磷酸化，而基因沉默則降低其磷酸化水平，提示整合素 β1 可能通過激活 PI3K - Akt 和 MEK - ERK 信號(hào)通路來調(diào)控表皮干細(xì)胞的增殖和分化。
信號(hào)通路抑制劑實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)使用 PI3K 抑制劑或 MEK 抑制劑后，整合素 β1 過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和分化的促進(jìn)作用被顯著削弱，進(jìn)一步證實(shí)了整合素 β1 通過這些信號(hào)通路發(fā)揮作用。

四、討論
本研究結(jié)果清晰地表明整合素 β1 在人表皮干細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。從細(xì)胞增殖角度來看，整合素 β1 的表達(dá)水平與表皮干細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)。這可能是由于整合素 β1 通過與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，激活了細(xì)胞內(nèi)的 PI3K - Akt 和 MEK - ERK 等增殖相關(guān)信號(hào)通路。這些信號(hào)通路的激活促進(jìn)了細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而推動(dòng)細(xì)胞增殖。
在細(xì)胞分化方面，整合素 β1 同樣表現(xiàn)出積極的促進(jìn)作用。其可能通過調(diào)節(jié)分化相關(guān)基因的表達(dá)以及影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，促使表皮干細(xì)胞向終末分化狀態(tài)發(fā)展。這種調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于皮膚組織在正常生理狀態(tài)下維持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性至關(guān)重要。例如，在皮膚的自我更新過程中，表皮干細(xì)胞需要適時(shí)地啟動(dòng)分化程序，以補(bǔ)充衰老或受損的表皮細(xì)胞，而整合素 β1 可能作為一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子參與其中。
從臨床意義角度分析，我們的研究結(jié)果為一些皮膚疾病的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的思路。在某些皮膚損傷修復(fù)困難的疾病中，如慢性難愈合性潰瘍，可能存在表皮干細(xì)胞功能異常，其中整合素 β1 的表達(dá)或功能失調(diào)可能是一個(gè)重要因素。通過調(diào)控整合素 β1 的表達(dá)或其下游信號(hào)通路，有望改善表皮干細(xì)胞的增殖和分化能力，從而促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)。此外，在燒傷后的瘢痕形成過程中，表皮干細(xì)胞的過度增殖和異常分化可能與整合素 β1 的異常激活有關(guān)。進(jìn)一步研究整合素 β1 在這些病理過程中的作用，可能為開發(fā)新的治療策略提供靶點(diǎn)。

五、結(jié)論
綜上所述，我們通過一系列實(shí)驗(yàn)全面深入地研究了整合素 β1 對(duì)人表皮干細(xì)胞增殖分化的作用。結(jié)果表明整合素 β1 可通過激活 PI3K - Akt 和 MEK - ERK 信號(hào)通路促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖和分化。這一研究為深入理解表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及皮膚生理病理過程提供了重要依據(jù)，同時(shí)也為皮膚疾病的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和策略方向。未來的研究可進(jìn)一步探索整合素 β1 與其他細(xì)胞因子或信號(hào)分子之間的相互作用，以及在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下其對(duì)表皮干細(xì)胞功能的影響，以更全面地揭示表皮干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。