四維核酸雜交技術(shù)介紹

定義

四維核酸雜交技術(shù)[ 1 ]（4DH），即在傳統(tǒng)核酸雜交三維空間(XYZ：表征DNA片段的長度、堿基組成和堿基的排列)的基礎(chǔ)上引入溫度作為第四位參數(shù)所構(gòu)成的四維溫度空間平臺上建立的核酸雜交技術(shù)。

背景

基因組(genome)是指人類細胞中所有遺傳信息的總和�；�因組信息是由脫氧核糖核酸(又稱為DNA)攜帶的�；�因組的DNA是一種由4種堿基(A,G,C和T)組成的雙鏈聚合體，這種雙鏈結(jié)構(gòu)的每條單鏈核苷酸鏈都以磷酸核糖為骨架，其堿基順序稱作DNA的一級序列結(jié)構(gòu)。基因組DNA的兩條鏈是通過每條鏈上互補堿基間氫鍵的相互作用而連結(jié)在一起的。堿基的化學結(jié)構(gòu)顯示，A與T相互作用形成兩對氫鍵（而不與其他任何堿基作用），G與C相互作用形成三對氫鍵（而不與其他任何堿基作用）。DNA固有的內(nèi)部雙鏈以及堿基對相互作用的精確性在雜交過程中被利用。雜交是兩條互補的單鏈核苷酸鏈之間形成一條穩(wěn)定的雙股螺旋雙鏈結(jié)構(gòu)的過程。雜交反應可以在溶液中兩個互補單鏈之間發(fā)生，也可以一個溶液中的單鏈和固定在固相載體上的互補單鏈之間發(fā)生。而DNA芯片分析（或基因芯片分析）是利用了標有熒光的單股核苷酸鏈與DNA芯片上的單股序列鏈的雜交反應，是一種核酸雜交生物化學過程，這是DNA芯片（或基因芯片，也稱DNA微陣列或基因微陣列）的原理基礎(chǔ)，也是PCR技術(shù)中引物（寡核苷酸鏈）和樣品靶（核苷酸單鏈）相互作用的基礎(chǔ)。

基因芯片（或稱DNA芯片）技術(shù)是基于堿基互補原理，在固體芯片表面（數(shù)平方厘米）按一定的排列組合陣列集成大量的DNA探針，通過與待測DNA（或基因）進行雜交反應，進而一次對大量DNA（或基因）進行平行快速分析檢測的技術(shù)。

PCR技術(shù)是利用人工合成的引物（寡核苷酸鏈）在適當退火溫度（或雜交溫度）下與樣品靶（核苷酸單股鏈）雜交后，由聚合酶在引物3’端按照靶序列的互補堿基逐個連結(jié)成一條新寡核苷酸鏈的周期過程，在經(jīng)過幾十個周期后可將樣品靶核苷酸鏈經(jīng)過擴增放大上百萬倍。

由此可見，核酸的雜交反應（DNA單股之間稱Southern雜交，DNA和RNA單股之間稱Northern雜交）是核酸分子生物學和基因診斷技術(shù)的基礎(chǔ)平臺。

問題

傳統(tǒng)的觀念認為核酸的Southern或Northern雜交是絕對特異性一對一堿基配對的，但是，事實上并不是如此完美的。當雜交溫度有偏差時，錯配一、二個堿基或簡并能態(tài)的情況同樣可以形成寡核苷酸雜交對。

開發(fā)PCR試劑盒都是用純凈單一序列的核酸鏈經(jīng)優(yōu)化過程而得出，當遇到包羅萬象的臨床樣品時，由于提取的核酸往往是總核酸，其中只要有與引物探針是同源序列、近源序列（錯一、二個堿基）或簡并能態(tài)的部分，就有可能出非特異的假陽性信號。

基因芯片技術(shù)是繼PCR技術(shù)之后又一個與基因相關(guān)的熱門技術(shù)。基因芯片技術(shù)已經(jīng)發(fā)展十幾年，但是，一直無法上臨床。為什么？用臨床診斷檢驗員的話來說，再重復性不好。為什么不好？因為現(xiàn)有基因芯片技術(shù)采用的是傳統(tǒng)雜交——即Southern雜交技術(shù)，即采用的是單一雜交溫度（常用40°C）�；�因芯片上排列著無數(shù)不同堿基排列組合的探針，每一種堿基排列組合的探針有自己特有的Tmp值（與最佳雜交配對相關(guān)的特征熔點溫度）。Tmp值無法準確或者說確定計算（因為量子力學方程式無解析解或稱推理解），傳統(tǒng)方法是靠實驗優(yōu)化篩選測量得出。雜交溫度與Tmp不匹配，就會造成探針與樣本靶單鏈之間可能存在錯配一、二個或者更多堿基�，F(xiàn)有基因芯片都是采用先將樣本單鏈標記上熒光素，然后再與探針在均一的溫度條件下雜交，依據(jù)測量到的熒光強度的大小來判定結(jié)果陰陽，高于某一預設(shè)熒光強度結(jié)果為陽性，低于則為陰性。但是，如果樣本中存在足夠數(shù)量錯配一、二個堿基的單鏈序列，而雜交溫度又不匹配（如過低），就會出現(xiàn)假陽性信號；如果雜交溫度過高，又會造成某些Tmp值偏低（前提是Tm無法確定計算出，而且簡并態(tài)無數(shù)）的探針不能與樣本單鏈雜交上，出現(xiàn)假陰性信號。這就是Southern雜交存在的缺陷。當然Northern雜交和原位雜交等傳統(tǒng)三維雜交也存在同樣缺陷。

正是由于傳統(tǒng)雜交存在一定數(shù)量的假陽性信號，也造成在PCR的分析中存在一定數(shù)量假陽性信號，在應用傳統(tǒng)雜交的DNA指紋鑒定中也同樣存在一定數(shù)量的假陽性信號。這些缺陷都可以利用四維雜交技術(shù)（4DH）來克服。

解決方法

由于量子力學方程式無解析解，所以沒有準確公式能夠計算出DNA片段的熔點溫度值（Tmp），近似估算值往往與實際值相差懸殊，實際應用中又必須知道準確值，才能確定最佳雜交條件，所以許多廠家和公司開發(fā)產(chǎn)品時，不得不通過一個又一個優(yōu)化實驗來獲得最優(yōu)條件。四維雜交技術(shù)是在四維溫度空間里來考慮基因芯片上各個DNA探針雜交溫度不一致的問題，采用溫度掃描的辦法，測量比較各個點的特征熔點溫度Tmp值，從而給出陰陽信號判定結(jié)果。這也就給出了大規(guī)模測定寡核苷酸片段熔點溫度(Tmp)的簡便方法，這無論是對科學研究人員，還是對診斷試劑廠家，都帶來了極大的方便和效率�，F(xiàn)在的基因診斷試劑都離不開探針和引物（PCR技術(shù)離不開引物，現(xiàn)有全自動基因測序儀離不開引物）——這都是寡核苷酸片段，其熔點溫度(Tmp)對基因診斷試劑盒是致關(guān)重要的。

采用四維雜交技術(shù)，必須使用四維雜交反應試劑[ 2 ]。過去使用的PCR過程結(jié)束后立即進行溫度掃描分析熔解曲線的方法，得出的特征熔點溫度Tmp值，單管反應過程的再重復性不好。加入四維雜交反應試劑后，結(jié)果穩(wěn)定，單管反應過程的再重復性非常好。而且可以讓PCR的TaqMan探針模式結(jié)果做熔解曲線分析！排除掉假陽性信號。這是因為一般PCR商業(yè)試劑盒反應液是針對聚合酶的特異活性優(yōu)化而來的最佳反應條件，這個最佳反應只是對聚合酶的擴增反應是最優(yōu)化的，對核酸雜交反應不一定是最佳反應條件！而四維雜交反應試劑是針對核酸雜交反應的特異性而進行最優(yōu)化后得到的條件，更適合于核酸雜交反應。四維雜交反應試劑用于基因芯片分析，也可以很好解決傳統(tǒng)雜交基因芯片有關(guān)再重復性不佳的問題。而依據(jù)相關(guān)專利設(shè)計出的四維基因芯片系統(tǒng)可以不用標記樣品靶鏈，簡化了樣品處理，更適合臨床使用。詳情參見專利文獻（美國專利：US7，101，671）

傳統(tǒng)三維雜交技術(shù)與創(chuàng)新四維雜交技術(shù)之間關(guān)系

如果將核酸雜交技術(shù)比喻成分子生物學的地基或平臺，一點也不為過。如果在傳統(tǒng)三維雜交技術(shù)平臺上建筑分子生物學房子，就好象在沙灘上建房子，蓋一層平房甚至二三層樓，可能都是不會有問題。但是，要蓋分子生物學摩天大廈時就不能建立在沙灘這樣的地基上（否則要癱塌），而要建立在堅實的巖石地基上。四維雜交技術(shù)就是建筑分子生物學摩天大廈所需要的堅實巖石地基！傳統(tǒng)三維雜交技術(shù)只是四維雜交技術(shù)的一個特例，但是，四維雜交技術(shù)的再重復性要遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)三維雜交技術(shù)。這里指的再重復性是指不同時間之間的重復性、不同地點之間的重復性、不同操作者之間的重復性和不同種類反應之間的重復性，而不是單指同一時間、同一地點、同一操作者和同一種反應之間的可重復性，即此處指的再重復性是指客觀規(guī)律的可重復性。這就是四維雜交技術(shù)的學術(shù)和商業(yè)價值！一項技術(shù)是否成熟，其結(jié)果的再重復性是一個極其重要標志。只有實際使用中結(jié)果的再重復性非常好，才能將高精尖的科技轉(zhuǎn)化為工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中可重復使用的生產(chǎn)力，造福于人類。

注解：

1．中國專利：CN1164769；美國專利：US7，101，671；國際專利：PCT/CN02/00751。

2．參見《四維雜交反應試劑使用說明》。