人白細胞介素6（IL-6）定量檢測試劑盒（ELISA）使用說明書

例：人白細胞介素6（IL-6）定量檢測試劑盒（ELISA）

【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：人白細胞介素 6（IL-6）定量檢測試劑盒（ELISA）
英文名稱：Huamn Interleukin-6（IL-6）ELISA KIT

【包裝規(guī)格】
48 人份/盒，96 人份/盒

【預期用途】
僅供科研使用，定量檢測血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液中人白細胞介素 6（IL-6）的濃度。

【檢驗原理】
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被抗人白細胞介素 6（IL-6）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入人白細胞介素 6（IL-6）校準品和待測樣本，再加入另一株 HRP 標記的抗人白細胞介素 6（IL-6）抗體（酶標抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標抗體的夾心復合物。加底物 A 和 B，底物在 HRP 催化下，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標儀上測定吸光度（OD 值），吸光度（OD 值）與待測樣品中人白細胞介素 6（IL-6）的濃度正相關。擬合校準品曲線，可以計算出樣本中人白細胞介素 6（IL-6）的濃度。

【主要組成成分】
主要成分
組分    數(shù)量    主要成分
校準品    0.5 ml/管*6 管    抗原配制的 6 個濃度標準品
包被微孔板    96T    預包被固相抗體
HRP 標記抗體    6 mL    HRP 標記的檢測抗體
底物液 A    6 mL    過氧化脲工作液
底物液 B    6 mL    TMB 工作液
20×濃縮洗滌液    30 mL    含 0.15%Tween20 的 PBS
說明書    1 份    --
自封袋    1 個    --
不干膠    2 片    --
校準品濃度依次為：320、160、80、40、20、0 pg/ml。校準品已經(jīng)通過測試，結(jié)果表明 HBs 抗原陰性，HIV1、HIV2 和 HCV 抗體陰性，由于不存在一種試驗方法能夠完全保證沒有這些物質(zhì)，本品必須按照具有潛在的感染性進行處理，處理過程應當遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材
1、酶標儀
2、精密移液器及一次性吸頭
3、蒸餾水
4、洗瓶或者自動洗板機
5、37℃ 水浴鍋或恒溫箱
6、500 ml 量筒
7、無粉一次性乳膠手套
8、質(zhì)控品

【儲存條件及有效期】
1、2-8℃ 保存，切勿冷凍，有效期 6 個月。
2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回 2-8℃ 冰箱。
3、開封后，按照建議的條件保存，校準品、包被微孔板和 HRP 標記抗體，有效期為 14 天，其他成分在標簽標明的有效期內(nèi)是穩(wěn)定的。

【適用儀器】
半自動的酶標儀，如 Thermo MK3，或者國產(chǎn)酶標儀。

【樣本要求】
樣本類型和采集
以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。
1、細胞培養(yǎng)上清：4000rpm 條件下離心 20 min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃ 以下，避免反復凍融。
2、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm 條件下離心 20 min，小心地分離出血清，保存在- 20℃ 以下，避免反復凍融。
3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在 4000rpm 條件下，離心 20 分鐘取上清，血漿保存在-20℃ 以下，避免反復凍融。

樣本保存和穩(wěn)定性
樣本在 2-8℃ 條件下，可以儲存 72 h，或者在- 20℃ 儲存 6 個月。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

【檢驗方法】
試劑準備
1、使用前，所有的組分都要至少復溫 30 min，確保充分復溫到室溫。
2、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按 1:20 稀釋，即 1 份的濃縮洗滌液，添加 19 份的蒸餾水。
3、底物：底物液 A 和 B，在使用前，按 1:1 體積充分混合，混合后 15 分鐘內(nèi)使用。

操作程序
1、所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質(zhì)控品和樣品，建議做復孔。
2、按前面試劑準備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。
3、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
4、設置標準品孔、樣本孔和空白孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL，樣本孔加待測樣本 50μL，空白孔不加。
5、除空白孔外，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體 100μL。
6、用封板膜蓋住反應板，37℃ 水浴鍋或恒溫箱溫育 60 min。
7、揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 20s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干。
8、如此重復 4 次（共洗板 5 次）。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡 20s 的程序，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。
9、將底物 A 和 B 按 1:1 體積充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃ 水浴鍋或恒溫箱溫育 15 min。
10、所有孔加入終止液 50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD 值）。

【檢驗結(jié)果的解釋】
檢測完成后，以標準品濃度做為縱坐標，對應的吸光度（OD 值）作為橫坐標，利用計算機軟件，采用四參數(shù) Logistic 曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD 值），利用方程計算樣品的濃度值。
如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度。

【檢驗方法的局限性】
1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
2、在試劑盒標示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。
3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。
4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。
5、如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。
6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果，檢測前，請排除該因素。
7、通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。

【產(chǎn)品性能指標】
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。
2、劑量反應曲線線性
校準品劑量反應曲線相關系數(shù) r 值，大于等于 0.9900。
3、精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù) CV% 小于 10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù) CV% 小于 15%。
4、靈敏度
最低檢出劑量小于 0.7pg/mL。
5、回收率
三組已知的高、中、低濃度樣品，進行五次回收率評估，回收率在 85%-115% 之間。
6、特異性
本試劑盒識別天然和重組人白細胞介素 6（IL-6），與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。
7、穩(wěn)定性
    2℃-8℃ 保存，有效期 6 個月。

【注意事項】
生物安全
1、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。
2、試劑盒的液體組分中，含有 proclin-300 防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧與皮膚接觸。
3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護手套，實驗完成后徹底洗手。

技術提示
1、混合蛋白溶液時，避免起泡。
2、加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。
3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結(jié)果準確性的必要條件。
4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。
5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。
6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

廢物處理
所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應當遵循傳染性或潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序，每個實驗室都有責任根據(jù)其實驗的類型和危險性級別，進行廢物和污物的處理，同時要嚴格依照有關規(guī)定對待所有的廢物和污物。


博舜聯(lián)合醫(yī)學實驗中心
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