恒溫核酸擴增反應(yīng)引物探針設(shè)計問題合集

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)（由英國公司開發(fā)）。以此為基礎(chǔ)的核酸擴增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

酶促重組等溫擴增（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA），由蘇州先達基因科技有限公司獨立自主開發(fā)，擁有全球自主知識產(chǎn)權(quán)，在低溫條件下(25-42℃)可對痕量的靶DNA片段進行特異性的擴增，在最適溫度35-40℃時，擴增反應(yīng)時間僅需15分鐘，以此達到核酸快速檢測的目的。該技術(shù)同樣對硬件設(shè)備的要求很低，現(xiàn)已應(yīng)用于研究診斷、公共衛(wèi)生、食品安全、水產(chǎn)畜牧等各個領(lǐng)域。

RPA和ERA的擴增引物可以說是整個反應(yīng)的關(guān)鍵所在，那么怎樣才能設(shè)計好其引物呢？

1、RPA引物需要多長？

RPA引物一般在32至35個核苷酸之間。某些情況可能用到少于30個核苷酸的引物，但擴增過程會顯著減緩。

ERA 引物需要多長？  

為了充分利用 ERA 的檢測速度和靈敏度，我們建議客戶使用 29-32 個核苷酸長 度的引物。通常情況下，PCR 引物可用于 ERA 反應(yīng)體系，但這類引物的檢測速 度和靈敏度可能不及較長的引物。

 

2、RPA引物應(yīng)當相距多遠？

這取決于你的具體應(yīng)用。標準試劑盒適用于不超過500bp的擴增產(chǎn)物。RPA擴增產(chǎn)物的大小是沒有下限的，不過RPA引物一般需要擴增子超過80bp。擴增產(chǎn)物在100-200bp之間，可以實現(xiàn)最快的RPA擴增。

ERA 引物應(yīng)當相距多遠？

一般而言，我們建議兩個 ERA 引物產(chǎn)生的擴增片段不應(yīng)超過 300bp。ERA擴增片段的大小或許沒有下限，不過根據(jù) ERA 引物最小長度，擴增片段的大小最小 約 80bp。為了獲得最快的檢測速度，最終的擴增片段長度應(yīng)為 100-200bp。

 

3、RPA 我需要篩選多少引物？

這取決于你對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果目標分子上千，那么絕大多數(shù)引物都夠用了。對靈敏度要求很高的話，最好是進行系統(tǒng)性的引物篩選。一開始篩選的時候，候選引物可以有10到20對。測試的引物越多，找到好引物的幾率也就越大。

ERA 我需要篩選多少引物？

這取決于您對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果您只需要每個反應(yīng)檢測 1000 個分子或以上，那么大多數(shù)引物對都夠用了。對于極高靈敏度的檢測，最好是進 行系統(tǒng)性的引物篩選以找到好的 ERA 引物。最初篩選時，測試的引物條數(shù)通常 是正反向引物各 7 條。測試的引物越多，找到能夠檢測單個分子的好引物對的幾率就越大。

 

熒光型ERA產(chǎn)品探針設(shè)計

1. 探針長度為 46-52 個核甘酸，其中至少 30 個位于 THF 位點的 5’端，另外至少 15 個位于其 3’端。
2. 熒光團與淬滅團只能標記在胸腺嘧啶（T）上，且熒光團與淬滅團間距在2-5個堿基。
3. THF為替換位于熒光團與淬滅團之間的某堿基，且dT-熒光團或 dT-淬滅團與 THF 之間的核苷酸數(shù)量可以是 0、1 或 2。
4. 探針的3’端需加上阻斷基團

 

試紙型ERA產(chǎn)品探針設(shè)計 

1. 探針長度為 46-52 個核甘酸，其中至少 30 個位于THF位點的 5’端，另外至少15個位于其 3’端。
2. THF為替換位于熒光團下游30bp后與阻斷基團上游15bp之間的某堿基
3. 熒光團只能標記在胸腺嘧啶（T）上。
4. 探針的3’端需加上阻斷基團

 

反應(yīng)需要用多少引物？

基礎(chǔ)反應(yīng)每次需要480nM引物，有時，稍微改動一下引物的用量可以提高其性能。對不同引物濃度進行測試（從200nM 到600nM）將有助于找到最合適的引物濃度。

 

反應(yīng)需要用多少探針？

反應(yīng)一般每次需要120nM探針。不過，略微改變探針的濃度有時會促進反應(yīng)的進行。我們可以在一定濃度范圍內(nèi)（從50nM到150nM），根據(jù)自己的具體應(yīng)用對探針進行優(yōu)化。

 

現(xiàn)成的PCR引物能用嗎？

RPA多半不行。絕大多數(shù)PCR引物不能用于RPA。

而通常情況下，PCR 引物可用于 ERA 反應(yīng)體系，但這類引物的檢測速度和靈敏度可能不及較長的引物。

 

現(xiàn)成的PCR探針能用嗎？

不能。絕大多數(shù)常用的PCR探針并不適合RPA或者ERA反應(yīng)。特別是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探針系統(tǒng)，這樣的酶活性完全不兼容。

 

篩選引物的時候必須用探針么？

不一定。任何檢測方法都可以用來評估候選引物的性能。不過對于篩選高靈敏度引物來說，用檢測探針對擴增進行實時監(jiān)控被證明是最快也最省力的方法。

 

引物篩選時應(yīng)該用什么樣的條件？

引物篩選的條件最好盡量模擬實際檢測時的條件，例如模板的拷貝數(shù)、樣本純度等等。

 

給定引物的性能還能再提高么？

一般來說，稍微改動一下引物的序列可以提高其性能。任何給定的引物都可以通過以下方法進行優(yōu)化：以單核苷酸為基礎(chǔ)略微改變引物的長度；或者保持引物長度不變，以1bp為基礎(chǔ)移動引物的位置。經(jīng)過了改動的引物，需要重新進行擴增活性的測試。

 

RPA引物的熔解溫度應(yīng)該是多少？

RPA和ERA反應(yīng)是在常溫下進行的，DNA的解鏈與PCR有很大不同。傳統(tǒng)估算的熔點不適用于這個系統(tǒng)。

 

引物需要特別純化么？

在進行引物篩選的時候，一般不需要純化。在其他情況下，引物的質(zhì)量會造成批次間的差異。如果對一致性要求比較嚴格，最好先純化引物再進行RPA或者ERA反應(yīng)。

 

使用引物和探針的時候還需要注意些什么？

引物和探針需要同時添加到體系中，一先一后會使片段重組出現(xiàn)偏向性。

 

我該如何選擇探針？ 

如果使用適用于探針的其中一種試劑盒，需要注意的是，在標靶區(qū)域選擇探針位置時，有一些序列限制。如果存在不合理的限制，本公司可幫助您設(shè)計備選檢測 方案。

 

我如何配制凍干引物、探針？

通常，用 TE（10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA）來制備 100μM 的儲存溶液， 并長期儲存于-20℃。