臺盼藍(Trypan Blue)染色法技術(shù)要點

臺盼藍 (Trypan Blue) 染色法是組織和細胞培養(yǎng)中最常用的死細胞鑒定染色方法之一。正常的活細胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺盼藍，細胞不被染色；而死細胞的胞膜不完整，通透性增加，可使臺盼藍滲入將細胞染成藍色。因此，借助臺盼藍染色可以簡單、快速地區(qū)分活細胞和死細胞。

想當年小編還是初入實驗室的小白時，以為臺盼藍染色的效果應(yīng)該是這樣的（左），然而現(xiàn)實卻是那樣的（右）
   

不是說好的“金標準”嗎？染成這樣哪里還能準？

如果你是Nexcelom的粉絲，從往期文章中應(yīng)該了解過臺盼藍染色法的局限性，以及當前最受認可的AO/PI熒光染核法的原理和優(yōu)越性（參考小知識）。
 

細胞的死亡狀態(tài)

在細胞實驗中，我們一般會遇到兩種類型的細胞死亡：一種是自然狀態(tài)下的死亡，即細胞自身的老化或營養(yǎng)耗盡造成的死亡，通常會經(jīng)歷比較長的過程；另一種是誘導(dǎo)的瞬間死亡，比如藥物處理、熱水浴等，通常會在短時間內(nèi)發(fā)生作用。兩種不同狀態(tài)的細胞死亡會讓臺盼藍染色出現(xiàn)不同效果嗎？

自然死亡

為了模擬細胞在自然狀態(tài)下的死亡，研究者將Jurkat細胞放置在常溫下，并在0，6，12，24，48，72，96和168小時后取出部分細胞和0.4%臺盼藍1：1混合染色。
 

 

從圖片中我們可以看到，從0-12小時，死細胞大多被染成較深的藍色；而從24小時起，我們會觀察到一些淺藍色呈彌散狀態(tài)的物體（紅色箭頭）。對于這樣的未知物，研究者們起了一個可愛的名字 – “氣球” [1]。這些“氣球“到底是什么呢？是細胞變的還是某種雜質(zhì)？

在下面的小視頻中，臺盼藍染料被緩緩加入在室溫培養(yǎng)了168小時的Jurkat細胞。大家可以清楚地看到部分細胞被染成藍色后迅速膨脹和破裂，染色隨即變淺，細胞失去形態(tài)變成“氣球“。整個過程僅幾秒鐘。
 

有視頻為證，這些“氣球“狀物體就是死細胞的殘骸。但當我們在顯微鏡下計數(shù)時，這些“氣球”由于顏色太淺通常不會被計在內(nèi)，因而導(dǎo)致死細胞的漏數(shù)和存活率的高估。研究者們將同樣的樣本用熒光核酸染料AO/PI或PI染色，并用Cellometer 細胞計數(shù)儀檢測了所有樣本的存活率。
 

從曲線圖中可以看出，臺盼藍染色測得的細胞存活率（藍色和紅色曲線）總是高于熒光染料AO/PI和PI測得的存活率（綠色和紫色曲線）。當存活率高于80%時，臺盼藍和熒光染料測得結(jié)果間的差距較�。欢�當存活率低于80%時，兩種方法測的結(jié)果間的差距會有顯著差距，最高可達30%！因此我們強烈建議對于存活率低于80%的細胞樣本應(yīng)該用熒光染核法（比如AO/PI）檢測細胞濃度和存活率[1]。

誘導(dǎo)的瞬間死亡

研究者們將Jurkat細胞分為兩份，一份用沸水浴處理15分鐘，一份不處理。處理過的細胞被認為0%存活，不處理的細胞被認為100%存活。將這兩份細胞按比例混合得到存活率為0，25，50，75和100%的細胞樣本。用0.4%臺盼藍或PI（碘化丙啶）熒光染料分別給樣本染色并用Cellometer 細胞計數(shù)儀計數(shù)。
 

上圖是預(yù)期存活率為100，50和0%的樣本的染色效果。不同于自然死亡的細胞，熱水浴誘導(dǎo)的死細胞臺盼藍染色后都變成了深藍色，形態(tài)完整，沒有出現(xiàn)“氣球“狀細胞。
 

 

此外，臺盼藍和PI染色測得的細胞存活率高度一致，也和預(yù)期存活率相當接近。為什么沸水浴處理的細胞和自然死亡的細胞在臺盼藍染色上會有這么大的區(qū)別呢？一個可能的原因是沸水浴增加了細胞膜的通透性但膜依然保持完整，使得臺盼藍可以滲入到死細胞中卻不會向外擴散。

根據(jù)這些圖片、視頻和數(shù)據(jù)，研究者們提出了一個假設(shè)：細胞膜通透性增加而依然完整時，臺盼藍可以滲入并留在細胞內(nèi)，細胞呈深藍色并具有細胞形態(tài)；當細胞膜進一步破損時，滲入的臺盼藍會撐開細胞膜并擴散到周圍，形成“氣球”狀物體，細胞形態(tài)隨之消失[1]。簡言之，此時的死細胞已經(jīng)”Hold”不住臺盼藍了。

臺盼藍濃度

不同的臺盼藍濃度對細胞染色會有不同影響嗎？Nexcelom的科學家們將同一Jurkat細胞樣本與0.4%，0.2%，0.1%，0.05%和0.025%的臺盼藍以1：1比例混合，以下是部分濃度染色后的細胞圖片：
 

下面的直方圖統(tǒng)計了不同濃度臺盼藍檢測到的死細胞（較深著色）和“氣球”狀細胞的濃度。
 

 

高濃度的臺盼藍更容易使死細胞破裂產(chǎn)生“氣球“，而當”氣球“顏色特別淺的時候容易被漏數(shù)。低濃度的臺盼藍不會產(chǎn)生”氣球“狀細胞，但過低的濃度可能不足以染上所有死細胞，使得檢測不夠靈敏。這兩種情況都會導(dǎo)致死細胞被低估，即存活率被高估[1]。Nexcelom公司建議所有Cellometer用戶使用0.2%的臺盼藍和細胞樣本1：1混合后（終濃度0.1%）上機檢測。

為了進一步研究不同濃度臺盼藍對細胞形態(tài)產(chǎn)生的影響，研究者分別用明場光學顯微鏡和相差顯微鏡對0.4%和0.1%臺盼藍染色的細胞進行拍照。
 

臺盼藍染色時間

臺盼藍是一種具有毒性的化學染料，若染色時間過長除了死細胞也會滲入活細胞，降低細胞的存活率。Mascotti等人在2000年發(fā)表的一篇文獻中專門研究了臺盼藍和AO/PI對細胞的毒性[2]。作者們將HPC細胞和0.4%臺盼藍或AO/PI染料混合后放置在室溫。在此后的2小時測量時間中，前一小時每隔10分鐘取一次樣計數(shù)，后一小時每隔15分鐘取一次樣計數(shù)。
 

上圖記錄了每個時間點兩種方法測得的存活率。AO/PI（實心點）染色的細胞在2小時區(qū)間內(nèi)始終保持很高的存活率（~98%），而臺盼藍（空心點）染色的細胞存活率從96.2%降到了89.8%。由此可見AO/PI對細胞的毒性非常小，而臺盼藍對細胞的毒性在2小時內(nèi)已經(jīng)十分明顯。所以臺盼藍染色后需要盡快完成細胞計數(shù)，一般建議不要超過10分鐘。

總結(jié)

綜上所述，要想用臺盼藍染色做好細胞計數(shù)和存活率分析，必須

1）樣本中雜質(zhì)少，且存活率在80%以上；

2）死細胞的狀態(tài)恰到好處，能”Hold”住臺盼藍；

3）臺盼藍濃度適中；

4）染色時間不超過10分鐘。

如果無法同時滿足這4個條件，那么趕緊使用以AO/PI為代表的熒光核酸染料吧。

如果你還對什么時候選擇什么染料有疑惑，請大膽留言或毫不猶豫地騷擾Nexcelom小編😀

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參考文獻

1. Chan et al.  Morphological observation and analysis using automated image cytometry for the comparison of trypan blue and fluorescence-based viability detection method. Cytotechnology. 2015 May;67(3):461-73.

2. Mascotti et al.  HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion. 2000 Jun;40(6):693-6.