基于磁珠的半自動、非接觸式和無移液吸頭的 DNA 純化

摘要
由于基于磁珠的核酸純化的易用性和可擴展性，其是過濾和離心方法的更好替代方法。磁珠懸浮液的顆粒性質和高粘度使得研究人員難以使用傳統(tǒng)的吸頭移液器對其進行移液。此外，為避免磁珠殘留和交叉污染，使用接觸式移液還會增加移液吸頭消耗，從而導致高運營成本和塑料浪費。我們在此介紹一種改進的半自動化工作流程，使用 MANTIS® 搭配 Blue®Washer 純化核酸，解決了傳統(tǒng)移液的痛點。
 
介紹
 基于磁珠的提取方法采用簡單的結合-洗滌-洗脫過程來分離和純化核酸。 當添加磁珠時， 磁珠可逆地結合到感興趣的分子上，將其從液相中移除。含有未結合雜質的剩余液體，可以通過清洗磁珠進行有效地去除。結合的純化核酸可用于下游加工。對于傳統(tǒng)的聚合物或無機磁珠，液相與磁珠的分離依賴于通過離心使磁珠沉降。
 
由于磁 (Mag) 珠具有超順磁性核心，可在外部磁場中被磁化，因而可以使用永磁體取代離心機將其制成顆粒。這樣的主要優(yōu)勢是在磁場被移除之前，珠粒能夠保持固定，而且簡化了移液并使過程更加自動化。
 
磁珠的大小范圍從幾納米到幾微米不等。由于磁珠大小與核心密度相聯(lián)系，所以磁珠懸浮液不穩(wěn)定。為了解決這個問題，在粘性液體中放入磁珠，以保持它們懸浮并防止在使用過程中快速沉淀。高粘度穩(wěn)定劑會造成磁珠難以被移液，這是因為它們會粘在移液吸頭上并需要液體類別優(yōu)化。在磁珠分液過程中，傳統(tǒng)的基于移液吸頭的移液器可能會導致磁珠體積不均勻，從而影響產(chǎn)量。同時，移液過程中的接觸會造成洗滌步驟中的高殘留量或微珠損失，從而降低純度或產(chǎn)量。同樣，為避免微珠殘留和交叉污染，接觸式移液過程的每個步驟都需要一套干凈的移液吸頭，這會增加吸頭消耗、運營成本和塑料浪費。
 
我們概述了半自動、非接觸式和無移液吸頭的 DNA 清理工作流程，在此過程中我們使用 MANTIS 分配 AMPure XP 珠子（Beckman Coulter，目錄號 A63880）以及使用 BlueWasher 進行清洗步驟，有效解決了上述限制。
 
儀器
 MANTIS®
 
MANTIS 是一種非接觸式高精度分液器，其死體積很低（圖 1）。這些關鍵功能由稱為“芯片”（表 1 中的規(guī)格）的獨特微流體泵實現(xiàn)。低容量 (LV) 和高容量 (HV) 芯片可以使用移液器吸頭作為輸入源來對價格昂貴的試劑進行分液。
   
MANTIS 的芯片可以處理高達 25 厘泊 (cP) 的液體，相當于室溫 (RT) 下 70% 的甘油溶液 [1]。與平均 AMPure 微珠 (1 μm) 相比，處理這種粘度和芯片流體通道 (380 μm) 直徑的能力能讓微珠均勻分配到多孔板上。此外，MANTIS 可以防止微珠沉降，因為珠子可以從放置在搖床/旋轉容器上的離心管中分配，以實現(xiàn)均勻懸浮。
 
MANTIS 軟件的一個獨特功能是內置的濃度歸一化向導。它即時執(zhí)行必要的計算，從讀板機導入標準數(shù)據(jù)輸出。  
Blue®Washer 
 BlueWasher 是一種非接觸式、無移液吸頭大體積液體分液器和微孔板清洗機（圖 2）。通過針頭歧管添加流體以進行清洗，而液體排空則通過離心技術而非吸液來完成。微量滴定板位于對稱轉子中，孔朝外以排出液體。板繞水平軸旋轉，液體通過離心力從孔中去除，通過被動排水管離開轉子室。對于磁珠 DNA 清理，磁性載體在液體離心抽空過程中保留磁珠。離心排空可減少殘留體積（0.01 μL/孔）和細胞/微珠洗滌過程中的變異性。 與 MANTIS 和 BlueWasher 的組合（圖 3）相比，我們展示了使用多通道移液器進行基于磁珠的 DNA 清理。   
我們計劃的工作流程展示了可以合并 MANTIS 和 BlueWasher 的步驟。

1.  使用 MANTIS 將 AMPure 微珠分配到樣品板的每個孔中。
2.  放入微珠并使用 BlueWasher 排空上清液。
3.  使用 BlueWasher 清洗微珠兩次。
4.  使用 MANTIS 向每個孔中添加洗脫緩沖液。
5.  用傳統(tǒng)的移液器轉移洗脫樣品。
6.   DNA 量化后，使用 MANTIS 執(zhí)行濃度歸一化。

 
總結
 磁珠是提取和純化核酸的有效手段。傳統(tǒng)的移液可能會導致磁珠的分配不均勻，從而導致缺乏重現(xiàn)性。相反，MANTIS 精確分配高粘度液體的能力能夠均勻分配磁珠。使用 BlueWasher 通過離心排出液體來清洗珠子可防止珠子殘留并最大限度地減少殘留體積（至 10 nL /孔）。此外，這兩種產(chǎn)品的無移液吸頭技術降低了運營成本和塑料浪費。此外，MANTIS 的濃度歸一化向導進一步簡化了工作流程。
 
總體而言，此工作流程僅保留一個傳統(tǒng)的移液步驟來轉移洗脫的樣品，從而節(jié)省了約 500 個吸頭/微孔板。動手時間和技巧成本減少了 83%（表 2）。雖然我們以手動移液為例說明了非接觸式工作流程的好處，但在由傳統(tǒng)液體處理程序自動化的基于磁珠的工作流程中，可以預期類似的成本降低。  
致謝
我們要感謝 BlueCatBio 的 Frank Feist 在開發(fā)本應用說明時提供的支持。BlueCatBio 的成立宗旨是“干凈的數(shù)據(jù)等于有前途的藥物發(fā)現(xiàn)。” Blue®Washer 是 BlueCatBio 的注冊商標；欲了解更多信息，請訪問 www.bluecatbio.com。