實驗方案：微流控混合方式制備mRNA脂質(zhì)納米顆粒（LNP）
實驗?zāi)康模?/strong>
參照Moderna和BioNtech的新冠疫苗配方，以ALC-0315、MC3、SM102為主要脂質(zhì)，制備包載mRNA的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）。
實驗原理：
ALC-0315、MC3、和SM102是三種可用于人體的可解離脂質(zhì)，在酸性條件下可質(zhì)子化形成陽離子脂質(zhì)，通過靜電作用和帶負(fù)電的mRNA結(jié)合，形成載有mRNA的脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs)。本實驗中采用微流控混合法，讓脂質(zhì)溶液與和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的形成粒徑均一的LNP。由于脂質(zhì)溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性緩沖液中，因此需要透析或者超濾去除殘余的乙醇并將溶液體系置換至中性緩沖液中。
實驗材料：
實驗步驟：
1.配制脂質(zhì)-乙醇溶液：
LNP 的成分與分子量見下表：
所有成分總濃度配置成12 mM（約7.5 mg/ml）的濃度。如果需要摸索磷脂對LNP最終粒徑的影響條件，可以配制以下濃度：8 mM（約5 mg/ml）、12 mM（約7.5 mg/ml）和16 mM（約10 mg/ml）。
備注：陽離子磷脂保存條件比較苛刻，常溫下接觸空氣后會發(fā)生氧化變質(zhì)。直接結(jié)果為超濾/透析后LNP粒徑出現(xiàn)異常增大（如粒徑增大一倍以上）。因此建議對陽離子磷脂進(jìn)行分裝冷凍保存，按照實際使用量按此使用。其它磷脂成分可以用乙醇配置為高濃度母液，短時間內(nèi)4 ℃或者-20 ℃保存。
2.計算mRNA濃度：
備注：雖然大多數(shù)的配方推薦的N/P比為6，但是大量的實驗表明，在后續(xù)的混合和超濾過程中，會損失20%左右的磷脂。所以在實踐中我們推薦的N/P比為8。更高的N/P比可以降低超濾和透析引起的粒徑變大，并提高mRNA的利用率。缺點(diǎn)是可能會增大對細(xì)胞的毒性，降低細(xì)胞的存活率。
根據(jù)N/P=8，F(xiàn)RR=3計算所需RNA濃度。
RNA的堿基的平均分子量為324，每個堿基攜帶1個磷酸，因此RNA中的含磷量為3.09 nmol/μg。
DNA的平均分子量按照318計算，DNA的含磷量為3.14 nmol/μg。
計算氮磷比時僅計算主要脂質(zhì)中的氮原子數(shù)，因此每摩爾混合脂質(zhì)中含有0.5摩爾N。
3.配制mRNA-檸檬酸緩沖液：
使用超純水分別配制100 mM的一水合檸檬酸(分子量:210.14，稱取1.05 g)和二水合檸檬酸鈉(分子量:294.10，稱取1.47 g)溶液各50 ml。
取33.0 ml檸檬酸溶液和17.0 ml檸檬酸鈉溶液，混合后加入DEPC，靜置30分鐘后高壓滅菌去除DEPC，滅菌后使用DEPC水定容至100 ml即得50 mM pH=4的檸檬酸緩沖液。
將mRNA測定濃度后根據(jù)脂質(zhì)濃度使用檸檬酸緩沖液稀釋至所需濃度。
4.微流控混合：
1.裝配微流控混合芯片和夾具： 
如圖2所示，裝入LNP混合芯片.
2.預(yù)沖洗管路和微混合芯片：
預(yù)沖洗保證微混合芯片內(nèi)部已經(jīng)預(yù)先充滿乙醇和檸檬酸緩沖液。
① 將無水乙醇和檸檬酸緩沖液通過0.22微米微孔濾膜過濾。
② 將無水乙醇吸入3 ml注射器中（吸入體積約0.7 ml），將檸檬酸緩沖液吸入3 ml注射器中（吸入體積約2.1 ml），并排出注射器中的空氣。在注射器上標(biāo)注“乙醇”和“緩沖液”。
③ 根據(jù)使用的注射器型號選擇合適的注射器適配器（如本實驗中選擇使用BD 3ml注射器適配器），將注射器的適配器裝載在設(shè)備卡槽中，抬起彈簧夾片，分別將“乙醇”和“緩沖液”注射器和樣品導(dǎo)入管連接，并安裝在LNP合成儀上，如下圖所示。 
④ 組裝完成的LNP合成儀和芯片夾具如圖所示：
⑤ 按照以下步驟選擇合適的注射器型號、注射體積和流速。
（以LNP-B1為例，BD 3ml注射器，流速比1:3，總流速12 ml/min，產(chǎn)物總體積為4ml）。
a. 選擇注射器設(shè)置： 
b. 脂相（乙醇）設(shè)定：
c. 水相（緩沖液）設(shè)定： 
⑥ 將廢液管放置在夾具樣品收集管下，收集流出的廢液。
⑦ 點(diǎn)擊開始，開始沖洗管路和芯片。
3.微流控混合制備LNP：
① 分別將分別將脂質(zhì)-乙醇溶液和mRNA-檸檬酸緩沖液通過0.22微米濾膜過濾。
② 將脂質(zhì)-乙醇溶液吸入3 ml注射器中（根據(jù)需要，至少需要吸入0.5 ml），將mRNA-檸檬酸緩沖液吸入3 ml注射器中（至少吸入1.5 ml），并排出注射器中的空氣。
③ 將注射器出口和樣品導(dǎo)入管連接，并固定在注射泵上。
④ 用戶可根據(jù)具體需要來調(diào)整注射泵的流速和混合體積。推薦起始設(shè)定如下：
⑤ 點(diǎn)擊運(yùn)行，觀察流出管流速穩(wěn)定后（一般需要丟棄前100-200微升液體），用收集管收集流出的液體。一般在注射結(jié)束前1-2秒停止收集，丟棄最后1-2秒流出的液體（若配備自動切換前后廢的裝置，則需要在軟件中設(shè)置）。
備注：也可以將流速設(shè)置為以下數(shù)據(jù)，無需丟棄前廢液，收集所有的產(chǎn)物。
4.透析（或者超濾）與儲存：
透析：
實驗名稱：LNP包封率測定
實驗?zāi)康模?/strong>
對制備的LNP包封mRNA的效果進(jìn)行測定
實驗原理：
Quant-iT™RiboGreen®RNA試劑是一種超靈敏的熒光核酸染色劑，可檢測溶液中1-200 ng的核酸，這種核酸染料無法透過LNP，因此只有游離的未被LNP包載的核酸可以被結(jié)合。Triton-100作為一種表面活性劑常被用做破乳劑，使用1%的Triton-100處理獲得的LNP-mRNA可以使包載的核酸釋放，得到總核酸量。通過計算破乳前后核酸量的差異得到載藥量，再除以總核酸量即可得到包封率，即：
包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量
實驗材料：
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 檢測試劑盒（Thermo Fisher，R11490）
Triton™ X-100 （SIGMA-ALDRICH，T8787-100ML）
DEPC水
CellCarrier-96 Ultra Microplates （ PerkinElmer，6055308）
實驗步驟：
1.LNP制備：
見LNP制備流程。
2.試劑準(zhǔn)備（詳細(xì)參見說明書）：
將20xTE用DEPC水稀釋至1x；
用稀釋好的1XTE稀釋試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成2 μg/mL及100 ng/mL兩種終濃度；
用1xTE稀釋試劑盒中的QuantiT™ RiboGreen® Reagen，稀釋成200倍及2000倍兩種終濃度；
按照下表在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入以下試劑，做復(fù)孔：
High range 
Low range
3.LNP破乳
將Triton-100用1xTE稀釋到2%，取100 μl加入CellCarrier-96 Ultra Microplates，加入1 μl制備好的LNP，處理5分鐘，加入100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
4.LNP游離核酸測定
在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入100ul1xTE，取1μl制備好的LNP加進(jìn)去，混勻，加入100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
5.讀板
使用SPARK讀取熒光強(qiáng)度，激發(fā)光設(shè)置為480 nm，發(fā)射光為520 nm
6.數(shù)據(jù)處理
1）標(biāo)曲制備
Low range
2)樣品定量
載藥量=破乳后讀值-破乳前讀值
包封率（%）=載藥量/破乳后讀值
實驗名稱：使用LNP轉(zhuǎn)染細(xì)胞
實驗?zāi)康模?/strong>
以293T細(xì)胞為例，使用包封了eGFP-mRNA的LNP對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
實驗步驟：
1.細(xì)胞準(zhǔn)備：
鋪板擴(kuò)增細(xì)胞 （在24孔板中，按照細(xì)胞密度2.5×104 cell/ml，1ml/孔），孵育鋪板過夜。
推薦一個制劑鋪板18孔（6*3）。
2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
取出eGFP-mRNA LNP (50 µg/ml)，用opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至2.5 µg/ml，
例如: 如果需要最終轉(zhuǎn)染液1100 µl, 取55 µl mRNA LNP+ 1045µl opti-MEM)，命名為S1，后取S1 300µl +900µl opti-MEM，得S2，倍比稀釋，得S1-S5。
在每孔依次加入250µl LNP轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)孵育4、6、8、12、24、48小時后，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)。在48小時后，收集細(xì)胞，流式檢測GFP信號陽性率。
一般4小時GFP漸漸有表達(dá)，8小時后可見明顯綠色熒光。
圖5. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的表達(dá)效果圖。左側(cè)為明場照片，右側(cè)為熒光照片。
參照Moderna和BioNtech的新冠疫苗配方，以ALC-0315、MC3、SM102為主要脂質(zhì)，制備包載mRNA的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）。
實驗原理：
ALC-0315、MC3、和SM102是三種可用于人體的可解離脂質(zhì)，在酸性條件下可質(zhì)子化形成陽離子脂質(zhì)，通過靜電作用和帶負(fù)電的mRNA結(jié)合，形成載有mRNA的脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs)。本實驗中采用微流控混合法，讓脂質(zhì)溶液與和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的形成粒徑均一的LNP。由于脂質(zhì)溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性緩沖液中，因此需要透析或者超濾去除殘余的乙醇并將溶液體系置換至中性緩沖液中。
實驗材料：
| 試劑 | ALC-0315、MC3、SM-102 |
| DSPC | |
| DMG-PEG2000/ | |
| CHOLESTEROL | |
| 檸檬酸(C6H8O7•H2O) | |
| 檸檬酸鈉(C6H5Na3O7•2H2O) | |
| 無水乙醇 | |
| PBS緩沖液（pH 7.4）或者 20 mM Tris緩沖液（pH 7.4） | |
| 耗材 | 3 ml 注射器（BD 302113） |
| 3 ml 注射器（BD 302113） | |
| Millipore 15ml/100 kd超濾離心管 | |
| 微混合芯片 | FluidicLab LNP-B1 |
| 設(shè)備 | FluidicLab LNP合成合成儀（LNP-S1-L） |
| 動態(tài)光散射儀（本文中使用的為Malvern ZS90） | |
| 冷凍離心機(jī) | |
| 酶標(biāo)儀 |
實驗步驟：
1.配制脂質(zhì)-乙醇溶液：
LNP 的成分與分子量見下表：
| 名稱 | ALC-0315 | Dlin-MC3-DMA | SM102 | PEG2000-DMG | ALC-0159 | DSPC | CHOLESTEROL |
| 分子量 | 766.3 | 642.1 | 710.2 | 2509.2 | 2464.2 | 790.1 | 386.7 |
| 摩爾百分比 | 50% | - | - | 1.5 | 10% | 38.5% | |
| - | 50% | - | 1.5% | 10% | 38.5% | ||
| - | - | 50% | 1.5% | 10% | 38.5% | ||
| 每毫摩爾投料量 （ug） |
383.14 | 321.05 | 355.09 | 37.64 | 36.96 | 79.015 | 148.86 |
備注：陽離子磷脂保存條件比較苛刻，常溫下接觸空氣后會發(fā)生氧化變質(zhì)。直接結(jié)果為超濾/透析后LNP粒徑出現(xiàn)異常增大（如粒徑增大一倍以上）。因此建議對陽離子磷脂進(jìn)行分裝冷凍保存，按照實際使用量按此使用。其它磷脂成分可以用乙醇配置為高濃度母液，短時間內(nèi)4 ℃或者-20 ℃保存。
2.計算mRNA濃度：
備注：雖然大多數(shù)的配方推薦的N/P比為6，但是大量的實驗表明，在后續(xù)的混合和超濾過程中，會損失20%左右的磷脂。所以在實踐中我們推薦的N/P比為8。更高的N/P比可以降低超濾和透析引起的粒徑變大，并提高mRNA的利用率。缺點(diǎn)是可能會增大對細(xì)胞的毒性，降低細(xì)胞的存活率。
根據(jù)N/P=8，F(xiàn)RR=3計算所需RNA濃度。
RNA的堿基的平均分子量為324，每個堿基攜帶1個磷酸，因此RNA中的含磷量為3.09 nmol/μg。
DNA的平均分子量按照318計算，DNA的含磷量為3.14 nmol/μg。
計算氮磷比時僅計算主要脂質(zhì)中的氮原子數(shù)，因此每摩爾混合脂質(zhì)中含有0.5摩爾N。
| 脂質(zhì)濃度(mM) | 8 | 12 | 16 |
| N/P | 8 | 8 | 8 |
| FRR | 3 | 3 | 3 |
| RNA濃度(μg/μl) | 0.054 | 0.081 | 0.108 |
| DNA濃度(μg/μl) | 0.053 | 0.080 | 0.106 |
3.配制mRNA-檸檬酸緩沖液：
使用超純水分別配制100 mM的一水合檸檬酸(分子量:210.14，稱取1.05 g)和二水合檸檬酸鈉(分子量:294.10，稱取1.47 g)溶液各50 ml。
取33.0 ml檸檬酸溶液和17.0 ml檸檬酸鈉溶液，混合后加入DEPC，靜置30分鐘后高壓滅菌去除DEPC，滅菌后使用DEPC水定容至100 ml即得50 mM pH=4的檸檬酸緩沖液。
將mRNA測定濃度后根據(jù)脂質(zhì)濃度使用檸檬酸緩沖液稀釋至所需濃度。
4.微流控混合：
1.裝配微流控混合芯片和夾具：
如圖1所示，將夾具翻轉(zhuǎn)，右手撥開卡扣，打開夾具.
如圖2所示，裝入LNP混合芯片.
注意：芯片開口方向（logo正面）與夾具開口對準(zhǔn)，芯片要完全陷入卡槽中。
如圖3所示，合上卡扣，將夾具翻轉(zhuǎn)至正面，芯片裝載完成。
如圖4所示，將夾具放置在托盤上，托盤下放置廢液管和樣品收集管。
將磷脂溶液和mRNA溶液導(dǎo)入，即可制作LNP。
2.預(yù)沖洗管路和微混合芯片：
預(yù)沖洗保證微混合芯片內(nèi)部已經(jīng)預(yù)先充滿乙醇和檸檬酸緩沖液。
① 將無水乙醇和檸檬酸緩沖液通過0.22微米微孔濾膜過濾。
② 將無水乙醇吸入3 ml注射器中（吸入體積約0.7 ml），將檸檬酸緩沖液吸入3 ml注射器中（吸入體積約2.1 ml），并排出注射器中的空氣。在注射器上標(biāo)注“乙醇”和“緩沖液”。
③ 根據(jù)使用的注射器型號選擇合適的注射器適配器（如本實驗中選擇使用BD 3ml注射器適配器），將注射器的適配器裝載在設(shè)備卡槽中，抬起彈簧夾片，分別將“乙醇”和“緩沖液”注射器和樣品導(dǎo)入管連接，并安裝在LNP合成儀上，如下圖所示。
（以LNP-B1為例，BD 3ml注射器，流速比1:3，總流速12 ml/min，產(chǎn)物總體積為4ml）。
a. 選擇注射器設(shè)置：
b. 脂相（乙醇）設(shè)定：
c. 水相（緩沖液）設(shè)定：
⑦ 點(diǎn)擊開始，開始沖洗管路和芯片。
① 分別將分別將脂質(zhì)-乙醇溶液和mRNA-檸檬酸緩沖液通過0.22微米濾膜過濾。
② 將脂質(zhì)-乙醇溶液吸入3 ml注射器中（根據(jù)需要，至少需要吸入0.5 ml），將mRNA-檸檬酸緩沖液吸入3 ml注射器中（至少吸入1.5 ml），并排出注射器中的空氣。
③ 將注射器出口和樣品導(dǎo)入管連接，并固定在注射泵上。
④ 用戶可根據(jù)具體需要來調(diào)整注射泵的流速和混合體積。推薦起始設(shè)定如下：
| 微混合芯片 | 脂質(zhì)-乙醇相流速（mL/min) | 緩沖液相流速（mL/min) |
| LNP-B1 | 3 | 9 |
備注：也可以將流速設(shè)置為以下數(shù)據(jù)，無需丟棄前廢液，收集所有的產(chǎn)物。
| 微混合芯片 | 脂質(zhì)-乙醇相流速（mL/min) | 緩沖液相流速（mL/min) |
| LNP-B1 | 4.5 | 13.5 |
4.透析（或者超濾）與儲存：
透析：
- 樣品收集后，使用動態(tài)光散射儀測定LNP粒徑和均一度。正常結(jié)果如下圖所示：
- 制備后放入透析管（Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL）中加入14 ml PBS在搖床上透析，每2小時后換液一次，重復(fù)操作直至18小時后透析結(jié)束。一般透析或者超濾后粒徑和PDI均會略微增大。
- 保存于含有2%蔗糖的PBS，-80℃凍存。
- 樣品收集后，加入一倍體積的檸檬酸緩沖液/醋酸緩沖液稀釋。
- 使用Milipore 100 KD超濾管，3000 g離心超濾至愿體積的1/4。
- 補(bǔ)加PBS/Tris緩沖液至原體積，再次超濾至愿體積1/4。
- 重復(fù)步驟3兩次，將乙醇含量降低至0.5%以下。
- 最后一次使用含有蔗糖保護(hù)液的緩沖液超濾濃縮。
- 將超濾后的液體收集，-80℃凍存。
實驗名稱：LNP包封率測定
實驗?zāi)康模?/strong>
對制備的LNP包封mRNA的效果進(jìn)行測定
實驗原理：
Quant-iT™RiboGreen®RNA試劑是一種超靈敏的熒光核酸染色劑，可檢測溶液中1-200 ng的核酸，這種核酸染料無法透過LNP，因此只有游離的未被LNP包載的核酸可以被結(jié)合。Triton-100作為一種表面活性劑常被用做破乳劑，使用1%的Triton-100處理獲得的LNP-mRNA可以使包載的核酸釋放，得到總核酸量。通過計算破乳前后核酸量的差異得到載藥量，再除以總核酸量即可得到包封率，即：
包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量
實驗材料：
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 檢測試劑盒（Thermo Fisher，R11490）
Triton™ X-100 （SIGMA-ALDRICH，T8787-100ML）
DEPC水
CellCarrier-96 Ultra Microplates （ PerkinElmer，6055308）
實驗步驟：
1.LNP制備：
見LNP制備流程。
2.試劑準(zhǔn)備（詳細(xì)參見說明書）：
將20xTE用DEPC水稀釋至1x；
用稀釋好的1XTE稀釋試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成2 μg/mL及100 ng/mL兩種終濃度；
用1xTE稀釋試劑盒中的QuantiT™ RiboGreen® Reagen，稀釋成200倍及2000倍兩種終濃度；
按照下表在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入以下試劑，做復(fù)孔：
High range
3.LNP破乳
將Triton-100用1xTE稀釋到2%，取100 μl加入CellCarrier-96 Ultra Microplates，加入1 μl制備好的LNP，處理5分鐘，加入100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
4.LNP游離核酸測定
在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入100ul1xTE，取1μl制備好的LNP加進(jìn)去，混勻，加入100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
5.讀板
使用SPARK讀取熒光強(qiáng)度，激發(fā)光設(shè)置為480 nm，發(fā)射光為520 nm
6.數(shù)據(jù)處理
1）標(biāo)曲制備
High range
Low range
2)樣品定量
載藥量=破乳后讀值-破乳前讀值
包封率（%）=載藥量/破乳后讀值
實驗名稱：使用LNP轉(zhuǎn)染細(xì)胞
實驗?zāi)康模?/strong>
以293T細(xì)胞為例，使用包封了eGFP-mRNA的LNP對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
實驗步驟：
1.細(xì)胞準(zhǔn)備：
鋪板擴(kuò)增細(xì)胞 （在24孔板中，按照細(xì)胞密度2.5×104 cell/ml，1ml/孔），孵育鋪板過夜。
推薦一個制劑鋪板18孔（6*3）。
2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
取出eGFP-mRNA LNP (50 µg/ml)，用opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至2.5 µg/ml，
例如: 如果需要最終轉(zhuǎn)染液1100 µl, 取55 µl mRNA LNP+ 1045µl opti-MEM)，命名為S1，后取S1 300µl +900µl opti-MEM，得S2，倍比稀釋，得S1-S5。
| 55 µl mRNA LNP+1045µl opti-MEM | 300µl S1+900µl opti-MEM | 300µl S2+900µl opti-MEM | 300µl S3+900µl opti-MEM | 300µl S4+900µl opti-MEM | 900µl opti-MEM | |
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | Blank | |
| 稀釋后濃度（µg/ml） | 2.5 | 0.625 | 0.15625 | 0.039063 | 0.009766 | 0 |
| 實際給藥濃度（µg/ml） | 0.5 | 0.125 | 0.03125 | 0.007813 | 0.001953 | 0 |
在每孔依次加入250µl LNP轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)孵育4、6、8、12、24、48小時后，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)。在48小時后，收集細(xì)胞，流式檢測GFP信號陽性率。
一般4小時GFP漸漸有表達(dá)，8小時后可見明顯綠色熒光。
圖5. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的表達(dá)效果圖。左側(cè)為明場照片，右側(cè)為熒光照片。
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