嵌合抗體的制備及應(yīng)用
一．嵌合抗體簡介
人-鼠嵌合抗體，即抗體的可變區(qū)來自鼠單克隆抗體，而恒定區(qū)則來自人的抗體。它是通過從雜交瘤細胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接,插入適當表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞表達產(chǎn)生。嵌合抗體既保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力，又大大減少了鼠源性在人體內(nèi)的免疫原性，其半衰期明顯延長，且在介導(dǎo)CDC及ADCC方面亦明顯增強。
圖1 嵌合抗體示意圖
二．嵌合抗體制備（關(guān)鍵技術(shù)與方法）
1. 可變區(qū)基因克隆
1.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
取對數(shù)生長期的雜交瘤細胞株約107個細胞，按照Trizol RNA提取試劑盒的說明書抽提細胞的總RNA，再進行RT-PCR擴增，回收純化擴增產(chǎn)物備用。
1.2 擴增輕鏈、重鏈的V區(qū)基因
根據(jù)Orlandi等（1989）設(shè)計的擴增小鼠可變區(qū)基因的引物，以上述擴增產(chǎn)物為模板擴增抗體基因的可變區(qū)�；厥罩劓淰H（約360 bp）、輕鏈VL （約330bp）片段，插入Teasy載體，各送3份樣品測序。測序所得序列在GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行分類及同源性分析。
兩端加入酶切位點：根據(jù)上述PCR產(chǎn)物序列設(shè)計含酶切位點的引物，再次進行擴增，以使抗體可變區(qū)基因片段具有與載體相吻合的酶切位點，便于插入表達載體�；厥占兓瘮U增產(chǎn)物備用。
2. 嵌合抗體表達載體構(gòu)建
2.1 改造含信號肽人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因片段的單克隆位點
設(shè)計含重鏈信號肽起始位點序列及酶切位點Nhe I的上游引物HLF （KOZAK+4G,即GCCGCCATGG），和含Xho I位點的下游引物HLR，以質(zhì)粒pAc-K-CH3為模板，擴增出重鏈信號肽基因片段；設(shè)計含XhoI和KpnI位點上游引物HCF，和含F(xiàn)urin（RKRR）序列及酶切位點Xba I的下游引物HCR，以質(zhì)粒pAc-K-CH3為模板，擴增出重鏈恒定區(qū)基因片段片段；用Xho I連接上述片段得到含重鏈信號肽、MCS及重鏈恒定區(qū)的基因片段。
設(shè)計含酶切位點Apa I的上游引物LLF，和含EcoR I位點的下游引物LLR，以質(zhì) 粒pAc-K-CH3為模板，擴增出輕鏈信號肽基因片段；設(shè)計含EcoR I和Hind I位點上游引物LCF，和含Pme I的下游引物LCR，以質(zhì)粒pAc-K-CH3為模板，擴增出輕鏈恒定區(qū)基因片段片段；用EcoR I連接上述片段得到含輕鏈信號肽、MCS及輕鏈恒定區(qū)的基因片段。
2.2 構(gòu)建含信號肽及人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因片段表達空載體
用合成的含酶切位點（XbaI和ApaI）的2A序列連接上述重、輕鏈，得到含信、號肽及人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因的基因片段LigC （Leader + Ig Constant）。然后與Nhe I和Pme I雙酶切過的pcDNA3.1-CA大片段連接，即得到嵌合抗體真核雙表達載體 pcDNA3. 1-CA（ chimeric antibody, CA）。
圖2 pcDNA3.1圖譜
2.3 插入含數(shù)源Ig重鏈和輕鏈V區(qū)基因
雙酶切表達載體pcDNA3.1-CA和純化的VL，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化目的片段后，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出pcDNA3.1-CA-VL陽性克隆，富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。然后，雙酶切表達載體pcDNA3.1-CA-VL和純化的VH，分離純化相應(yīng)的酶切片段，重復(fù)上述步驟，構(gòu)建成重組表達載體pcDNA3.1-CA-XX（抗原單詞的首字母）。
3. 轉(zhuǎn)染Sp2/0細胞
接種適量Sp2/0細胞于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12h后用純化的載體pcDNA3.1-CA-XX DNA，采用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染，按試劑盒使用說明書進行。設(shè)置空載體和無載體的細胞為對照。轉(zhuǎn)染72h后，加含MTX的選擇性培養(yǎng)基進行篩選。2周后將生長出的陽性克隆利用有限稀釋法單克隆化。
4. 陽性克隆鑒定與篩選
以間接法用抗原和酶標羊抗人IgGFc片段抗體檢測嵌合抗體的特異性及重組性。以適量抗原包被酶標板，加細胞培養(yǎng)上清反應(yīng)后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶標抗體（經(jīng)鼠Ig吸附過）孵育，顯色后測A490吸光值。
5. 抗體腹水生產(chǎn)
腹腔種植轉(zhuǎn)染瘤細胞，5~7天后抽取腹水。一只種植雜交瘤細胞的小鼠有時可產(chǎn)生多達10ml的腹水。王碩等（2003）報道稱從腹水中獲得的嵌合抗體產(chǎn)量可達1~2mg/ml。
三．嵌合抗體的應(yīng)用
嵌合抗體目前主要用于藥物治療方面，與鼠抗相比，嵌合抗體既保留了鼠源可變的高親和性，又具有人Fc段的多種免疫殺傷功能，從而大大降低了人抗鼠抗體反應(yīng)的發(fā)生幾率，改善了臨床治療效果，與其它小分子基因工程抗體相比，嵌合抗體作為完成的抗體分子，在體內(nèi)半壽期更長，并具有人Fc段的多種免疫殺傷功能。
