長讀長測序技術(shù)在過敏性疾病研究中的作用

什么是過敏性疾�。�
過敏性疾病，也被稱為變態(tài)反應(yīng)性疾病，是由人體免疫系統(tǒng)對某些外界物質(zhì)產(chǎn)生異常反應(yīng)而引起的一類疾病。當(dāng)人接觸到過敏原時，會在血液中產(chǎn)生一種特異性免疫球蛋白E抗體（IgE），對某種特定的過敏原產(chǎn)生過敏反應(yīng)。過敏性疾病的發(fā)生具有遺傳傾向，且近年來患病率呈上升趨勢。
 
過敏性疾病根據(jù)病因，可分為以下幾類：
1.呼吸道過敏性疾病：過敏性咽炎、過敏性鼻炎、哮喘等；
2.皮膚過敏性疾�。菏n麻疹、濕疹、藥疹、接觸性皮炎等；
3.消化道過敏性疾�。菏澄锏鞍渍T導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎綜合征、食物蛋白誘導(dǎo)的腸病等；
4.眼部過敏性疾�。哼^敏性結(jié)膜炎；
5.全身系統(tǒng)性過敏性疾�。哼^敏性休克、過敏性紫癜等。
 
長讀長測序技術(shù)：助力解鎖過敏性疾病研究
納米孔測序等長讀長測序技術(shù)以其超長的讀長、實時檢測和直接檢測堿基甲基化修飾等優(yōu)勢，在醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。這項技術(shù)能夠完整組裝拼接物種全基因組，發(fā)現(xiàn)新的過敏源，并且能深入分析個體的基因組，識別與過敏性疾病相關(guān)的遺傳變異，為疾病的預(yù)防、診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。
 
1、塵螨Dermatophagoides farinae染色體級別基因組和轉(zhuǎn)錄組組裝揭示兩種新過敏原Der f 37和Der f 39
 
塵螨（HDMs），特別是Dermatophagoides pteronyssinus（Der p）、Dermatophagoides farinae（Der f），是吸入性過敏原的主要來源。需要深入分析HDM過敏原的全譜，以闡明HDM過敏機制并指導(dǎo)診斷和免疫治療的發(fā)展。
準(zhǔn)確的塵螨（HDM）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將促進我們對HDM過敏原的理解。本研究旨在通過進行塵螨（Dermatophagoides farinae）的染色體級基因組組裝和精確的轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定新的過敏原。在本研究中，從HDM蟲體和卵中提取遺傳物質(zhì)，使用下一代測序（NGS）的短讀長序列和PacBio/Nanopore測序的長讀長序列來構(gòu)建D. farinae的核基因組、轉(zhuǎn)錄組和線粒體基因組。通過與WHO/IUIS過敏原數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列進行比對，篩選出候選同源物。
結(jié)果顯示，與D. farinae草圖基因組相比，本研究中獲得的測序讀段中來源于細(xì)菌DNA的占比大幅降低（從22.9888%降至1.5585%），基因組大小得到校正（從53.55 Mb增至58.77 Mb），并且組裝獲得的連續(xù)片段（contig）N50增加（從8.54 kb增至9365.49 kb）。組裝的基因組包含10個contig，極低的微生物污染，鑒定得到33個典型過敏原和2個新的過敏原�？寺×�8個同源性≥50%的同源物，其中2個與HDM過敏血清結(jié)合，被鑒定為過敏原（Der f 37和Der f 39）。綜上，本研究獲得了D. farinae的染色體級基因組、轉(zhuǎn)錄組和線粒體基因組，能夠支持過敏原鑒定和診斷及免疫治療疫苗的開發(fā)。
 
Fig.1 Chromsome-level assembly of genome and mitochondrion genome of D. farinae and identification of novel HDM allergens Der f 37 and Der f 39. A. Genome assembly showing locations of allergen genes. B. Mitochondrial genome of D. farinae. Mite allergens based on WHO/IUIS allergen nomenclature (http://www.allergen.org/search.php?TaxSource¼Animalia%20Arthropoda). Der f 17 sequence information: not available; HDM allergen Groups 12 and 19: not found; Der p 38 homolog in D. farinae (bacterial lytic enzyme like protein, GenBank accession No. MT360919.1) showed no IgE-binding activity in this study. C. IgE binding activity determined by IgE-western blots of rDsbA-Der f 37 with individual sera from 192 HDM-allergic patients and 20 healthy non-allergic individuals. D. Western blot assay identifying rDer f 37 protein binding by IgE in sera from 10 patients with HDM allergies (left) and 10 non-HDM allergic subjects (control, right). E. IgE binding activity determined by IgE-ELISA of rDer f 39 with individual sera from 76 HDM-allergic patients and 20 healthy nonallergic individuals. F. Western blot assay identifying rDer f 39 protein binding by IgE in sera from 7 patients with HDM allergies (left) and 10 non-allergic subjects (control, right). The HDM-specific IgEs (>100 kUA/L) within the sera samples were evaluated using an ImmunoCAP system.
 
使用Nanopore測序技術(shù)，除了Contig2外，所有contig都超過了2Mb，最長的一個超過了13Mb，表明組裝質(zhì)量達到了接近染色體級別。本研究注釋了組裝基因組中的33個典型過敏原基因，包括2個新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，即Der f 37和Der f 39，并確定了它們在相應(yīng)contig中的位置。為了獲得高質(zhì)量的基因集，我們對染色體級組裝結(jié)果進行了同源性分析、下一代RNA測序（RNA-seq）和基因組從頭注釋。研究者鑒定了10,684個蛋白質(zhì)編碼基因，并通過NCBI非冗余蛋白、SwissProt和KEGG數(shù)據(jù)庫對超過91.67%的基因進行了功能注釋。
 
在這項研究中，納米孔測序技術(shù)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，它通過提供長讀長序列數(shù)據(jù)，幫助研究者實現(xiàn)了對塵螨Dermatophagoides farinae基因組的染色體級別組裝。這種長讀長測序技術(shù)顯著減少了組裝過程中的缺失，提高了基因組的連續(xù)性和準(zhǔn)確性，從而使得基因組大小的校正、組裝序列N50的顯著提升以及基因組中過敏原的精確鑒定成為可能。此外，納米孔測序技術(shù)還有助于減少細(xì)菌DNA的污染，這對于提高基因組數(shù)據(jù)的質(zhì)量至關(guān)重要，進而支持了過敏原的識別和診斷及免疫治療疫苗的開發(fā)。

2、美洲大蠊基因組組裝和注釋揭示全面的蟑螂過敏原譜
 
美洲大蠊是城市地區(qū)最常見的蟑螂類型之一，已被報道有增加過敏和哮喘的風(fēng)險。由于缺乏基因組相關(guān)信息，這一物種中只鑒定出了有限的過敏原組（Per a 1–13）。
為了擴展美洲大蠊的過敏原譜，研究團隊采用基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組方法，基于蛋白質(zhì)同源性鑒定了潛在過敏原，并通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）在對美洲大蠊過敏的泰國患者中進行了測試。
研究結(jié)果表明，成功組裝了染色體級別的美洲大蠊基因組（3.06 Gb），并顯著提高了其連續(xù)性（N50 = 151 Mb）。鑒定了七組新的過敏原組，包括烯醇化酶（Per a 14）、細(xì)胞色素C（Per a 15）、絲束蛋白（Per a 16）、α-微管蛋白（Per a 17）、環(huán)肽（Per a 18）、孔蛋白3（Per a 19）和過氧化物酶6（Per a 20），并在Per a 7中鑒定了一個新的同種型變體（Per a 7.02）。此外，通過比較分析，揭示了與近緣的蜚蠊目物種之間可能存在的交叉反應(yīng)性。
 
Our high-quality genome (3.06 Gb) and precisely annotated proteome (29,939) of the American cockroach help revealed a broader allergen spectrum. Seven novel allergen groups Per a 14 to Per a 20 and one isoallergens (Per a 7.02) were validated using ELISA in Thai cohort.
Comparative analysis of P. americana with the closely related Blattodea species revealed the possibility of cross-reaction.
Abbreviations: ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; gDNA, genomic DNA; 
GST, glutathione S-transferases; SPT, skin prick test; MS, mass spectrometry
 
在這項研究中，納米孔測序技術(shù)提供了長讀長序列數(shù)據(jù)，有助于提升基因組組裝的質(zhì)量，尤其是在解決基因組中的重復(fù)區(qū)域和復(fù)雜結(jié)構(gòu)方面。通過與Illumina高通量測序和Hi-C技術(shù)相結(jié)合，納米孔測序技術(shù)使得研究者能夠構(gòu)建出一個更高連續(xù)性的基因組，這對于后續(xù)的過敏原發(fā)現(xiàn)和表征至關(guān)重要。這項研究的發(fā)現(xiàn)對于理解蟑螂引起的過敏疾病、開發(fā)新的診斷方法和特異性免疫療法具有重要意義。

3、RNA測序在乳糜瀉研究中的應(yīng)用綜述
 
近幾十年來，RNA測序（RNA-seq）技術(shù)取得了顯著進步，成為轉(zhuǎn)錄組分析的關(guān)鍵技術(shù)。從常規(guī)細(xì)胞群體測序（bulk sequencing）向單細(xì)胞和空間方法的轉(zhuǎn)變，將研究的精確度提高到了細(xì)胞層面，為理解個體免疫細(xì)胞及自身免疫病發(fā)展的分子機制提供了寶貴信息。在乳糜瀉（CeD）等自身免疫疾病研究中，RNA-seq技術(shù)尤為關(guān)鍵，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組比較、營養(yǎng)基因組學(xué)、小麥研究、CeD背景下的癌癥研究、基因與非編碼RNA介導(dǎo)的表觀遺傳研究、疾病監(jiān)測與生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、線粒體功能調(diào)控、治療靶點識別和藥物作用機制等多個領(lǐng)域。
 
長讀長cDNA測序和直接RNA-seq能提供更全面的亞型水平數(shù)據(jù)，尤其擅長識別短讀長方法難以檢測的亞型，在該研究領(lǐng)域正逐漸取代短讀長測序。相對于使用傳統(tǒng)NGS短讀長測序面臨的挑戰(zhàn)，基于PacBio長讀長測序技術(shù)為研究麩質(zhì)蛋白基因提供了解決方案，能夠精確獲取mRNA完整序列信息，結(jié)合RNA測序、蛋白質(zhì)組學(xué)分析和高級生物信息學(xué)工具，可更深入了解復(fù)雜麩質(zhì)蛋白及面包小麥中的乳糜瀉表位，促進麩質(zhì)蛋白作用研究并支持更健康小麥品種的開發(fā)。
 
 
長讀長測序技術(shù)在過敏性疾病研究的未來展望
長讀長測序技術(shù)因其明顯的優(yōu)勢特點，在過敏性疾病的研究中具有很大的應(yīng)用潛力：

• 基因組變異檢測：長讀長測序技術(shù)能夠檢測到基因組中的結(jié)構(gòu)變異，包括插入、缺失、倒位和復(fù)制等，這些變異可能與過敏性疾病的發(fā)生有關(guān)。
• 免疫組庫分析：過敏性疾病與免疫系統(tǒng)的反應(yīng)密切相關(guān)，長讀長測序可以用于免疫組庫的分析，幫助研究B細(xì)胞和T細(xì)胞受體的多樣性，進而了解免疫應(yīng)答的復(fù)雜性。
• 微生物組分析：腸道微生物組與過敏性疾病有關(guān)，長讀長測序有助于解析微生物群落的組成和功能，為研究過敏性疾病的微生物組基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)支持。
• 表觀遺傳學(xué)研究：DNA甲基化等表觀遺傳修飾可能影響過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展，長讀長測序技術(shù)能夠直接檢測這些修飾，有助于揭示表觀遺傳在過敏性疾病中的作用。
• 快速病原體檢測：對于由病原體引起的過敏性疾病，長讀長測序技術(shù)可以快速識別病原體的基因組序列，有助于病原體的鑒定和疫情監(jiān)控。
• 藥物基因組學(xué)研究：長讀長測序技術(shù)有助于研究藥物代謝酶和藥物靶點的基因多態(tài)性，為過敏性疾病的個體化治療提供信息。
• 疾病機理研究：長讀長測序技術(shù)可以揭示過敏性疾病相關(guān)的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號傳導(dǎo)途徑，增進對疾病機理的理解。
• 個性化醫(yī)療：通過長讀長測序技術(shù)，可以為過敏性疾病患者提供更精準(zhǔn)的基因組信息，有助于開發(fā)個性化的預(yù)防、診斷和治療方案。

過敏性疾病雖然普遍，但并非不可戰(zhàn)勝。隨著技術(shù)的不斷進步，納米孔測序等長讀長測序技術(shù)在過敏性疾病研究中的應(yīng)用前景廣闊。期待未來，長讀長測序技術(shù)能助力醫(yī)學(xué)科研工作者解鎖更多的過敏性疾病機制、深入理解過敏性疾病的遺傳機制，為患者帶來更精準(zhǔn)的治療方案。
 
參考文獻
[1]Chen J, Cai Z, Fan D, Hu J, Hou Y, He Y, Zhang Z, Zhao Z, Gao P, Hu W, Sun J, Li J, Ji K. Chromosome-level assembly of Dermatophagoides farinae genome and transcriptome reveals two novel allergens Der f 37 and Der f 39. World Allergy Organ J. 2021 Sep 28;14(10):100590. doi: 10.1016/j.waojou.2021.100590. PMID: 34659625; PMCID: PMC8487952.
[2]Wang L, Xiong Q, Saelim N, Wang L, Nong W, Wan AT, Shi M, Liu X, Cao Q, Hui JHL, Sookrung N, Leung TF, Tungtrongchitr A, Tsui SKW. Genome assembly and annotation of Periplaneta americana reveal a comprehensive cockroach allergen profile. Allergy. 2023 Apr;78(4):1088-1103. doi: 10.1111/all.15531. Epub 2022 Oct 5. PMID: 36153808.
[3]Shoaran M, Sabaie H, Mostafavi M, Rezazadeh M. A comprehensive review of the applications of RNA sequencing in celiac disease research. Gene. 2024 Jun 11;927:148681. doi: 10.1016/j.gene.2024.148681. Epub ahead of print. PMID: 38871036.