單細胞分選技術(shù)在B.SIGHT高效分離厭氧腸道細菌的應用

腸道微生物群及其研究的重要性
腸道微生物群是指存在于胃腸道中的多樣化微生物群落，它們在調(diào)節(jié)宿主健康中起著關(guān)鍵作用。現(xiàn)代科學研究表明，腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和功能變化與多種慢性疾病的發(fā)展息息相關(guān)，如代謝性疾病、炎癥性腸病和結(jié)直腸癌。因此，研究這些微生物群落的遺傳多樣性具有重要意義。近年來，隨著測序技術(shù)的進步，科學家們揭示了許多未知微生物的存在，反映出腸道微生物群的復雜性。然而，盡管測序技術(shù)提供了大量信息，基于培養(yǎng)的研究依然至關(guān)重要，因為它們不僅有助于正確分類和描述新微生物，還為后續(xù)的功能研究提供了可能。
 
腸道微生物分離與培養(yǎng)的挑戰(zhàn)
在從復雜菌落中分離和描述微生物的過程中，高效分離單個菌落成員以生成無菌培養(yǎng)物是一個重要步驟。由于人類糞便中的微生物群分布不均，這一過程變得更加復雜。獲得純培養(yǎng)物的傳統(tǒng)方法主要依賴于瓊脂平板上的菌落劃線或連續(xù)稀釋過程。在連續(xù)稀釋方法中，樣品在微孔板中連續(xù)稀釋，直到?jīng)]有觀察到細菌生長。雖然這種方法可以產(chǎn)生純培養(yǎng)物，但由于只有一小部分孔能夠產(chǎn)生微生物培養(yǎng)物，因此效率低且產(chǎn)量有限。所以，改進從復雜基質(zhì)中分離單個細胞的技術(shù)，對于提高培養(yǎng)方法的效率至關(guān)重要。
 
B.SIGHT：一種高效的單細胞分離方法
為了解決上述問題，我們在此介紹一種快速生成腸道細菌無菌培養(yǎng)物的簡化工作流程。繞過低效的有限稀釋步驟，我們采用專為快速分選單個微生物細胞并直接生成克隆培養(yǎng)物而設(shè)計的B.SIGHT系統(tǒng)。B.SIGHT可以將單個微生物細胞分離到液體培養(yǎng)基或固體瓊脂上。這種臺式的系統(tǒng)也可放置在厭氧工作站中，非常適合處理厭氧菌。
  我們使用B.SIGHT系統(tǒng)，成功獲得了1181個大腸桿菌和擬桿菌，以及1666個小鼠腸道細菌的克隆菌群。在最終培養(yǎng)物中，通過MALDI-TOF-MS鑒定了多達500個分離株，揭示了潛在的新物種的存在。此項研究不僅顯著提高了培養(yǎng)方法的效率，還為微生物分類和功能研究奠定了堅實基礎(chǔ)。
 
#材料和方法
 
1. 樣品和培養(yǎng)條件
大腸桿菌和硫化桿菌菌株來源于內(nèi)部細菌收集。來自小鼠腸道的復合微生物群是由先前生成的混合培養(yǎng)物中獲取的。菌株和樣本在厭氧條件下（89.3% N2, 4.7% H2, 6% CO2）于適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。然后將細胞分配到不同的培養(yǎng)基中（BHI，腦心浸液；WCA，Wilkins-Chalgren厭氧培養(yǎng)基；GMM，腸道微生物培養(yǎng)基）。所有材料和培養(yǎng)基在開始分離工作前24小時放入?yún)捬豕ぷ髡尽?br />  
2. B.SIGHT單細胞分離原理
B.SIGHT專為快速、簡單、溫和地分離單菌株而設(shè)計，能夠利用高分辨率成像技術(shù)進行微生物細胞分離。在實驗中，樣本首先加載到一個墨盒中，然后進入一個直徑為20 µm的噴嘴。當壓電傳感器驅(qū)動的活塞推動硅膜時，分配芯片會迅速按需生成小液滴。在操作過程中，對分配芯片噴嘴區(qū)域連續(xù)成像。檢測軟件會自動分析每個經(jīng)過的顆粒，確認下一個液滴中是否包含符合參數(shù)的單個細胞，只有符合條件的細胞才會被分配到下方的96孔或384孔板的一個孔中。多余的液滴，如空液滴或包含多個細胞的液滴，在分配之前會被真空去除（圖2A）。每個被分配液滴在噴嘴區(qū)域采集的圖像都會自動存儲，以便后續(xù)驗證單細胞分離的準確性（圖2B）。  
3. 微生物單細胞分離的工作流程
工作流程如圖3所示。在細胞分離之前，將單個細菌菌株或混合菌群在厭氧條件下的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，以獲得不含腸道內(nèi)容物碎片且具有足夠密度的細胞懸浮液。接著，將這些培養(yǎng)物在補充有0.5%（w/v）蛋白胨和還原劑的過濾滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中進行逐級稀釋。最終稀釋液通過10μm膜過濾，并分配（50-70μl）到帶有20μm噴嘴的無菌墨盒中，安裝在B.SIGHT儀器上以進行單細胞分配。B.SIGHT儀器的準備時間通常為5-10分鐘。單細胞被分配到裝有液體或瓊脂培養(yǎng)基的96孔板中。分配后，樣品在37℃下孵育1至7天。液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物隨后轉(zhuǎn)移到瓊脂板上進行進一步分析。  
4. MALDI-TOF-MS細菌鑒定
將待鑒定的每個細胞菌落直接點到MALDI靶標上，每個樣本加1μl α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)溶液，并在室溫下干燥。最后使用Microflex LT質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics，Germany）進行MALDI-TOF測量。
 
# 結(jié)果和討論
 
1. 單一菌株的克隆培養(yǎng)物
本實驗旨在評估單個菌株（每個孔理論上包含一個細胞）在孔板中生長的比例。實驗采用了兼性厭氧菌種大腸桿菌和嚴格厭氧菌種B. vulgatus，以驗證該方法對嚴格厭氧菌的適用性。在實驗中，我們處理了10個96孔板，共獲得800個單細胞孔（每塊板的兩行孔保留為陰性對照：空液滴和培養(yǎng)基各保留一行）。通過OD600吸光度測量，確定了表現(xiàn)出生長的孔的百分比。結(jié)果顯示，79.1±4.0%的孔對大腸桿菌呈陽性，68.5±5.3%的孔對B. vulgatus呈陽性（圖4a）。  
2. 從復雜小鼠腸道樣品中分離的單個細菌的鑒定
本實驗通過處理小鼠腸道復雜群落來評估其細菌多樣性。對于樣品1，將單細胞分配到六個固體瓊脂平板和九個液體培養(yǎng)平板上，共計1200個孔�？寺⌒�率即生長孔的比例，達到了87.6%（圖4a）。而樣品2，共使用七個固體瓊脂平板和三個液體培養(yǎng)平板，總計800個孔，單克隆比例為77.8%（圖2a）。孵育后，使用MALDI生物型測定技術(shù)對培養(yǎng)物進行鑒定。樣品1的分析結(jié)果表明，經(jīng)處理的465個分離株中至少包含八個不同的物種（圖4b）。樣品2則揭示了620個分離株，至少分屬于12個物種（圖4b）。在兩個樣品中，均發(fā)現(xiàn)了與MALDI數(shù)據(jù)庫不匹配的培養(yǎng)物，可能代表了小鼠腸道微生物群中的未知物種。
 
# 實驗結(jié)論
本文介紹了一種高通量培養(yǎng)工作流程，能夠生成大量單克隆培養(yǎng)物用于下游鑒定。B.SIGHT系統(tǒng)在單細胞分配到液體培養(yǎng)基和固體瓊脂上的過程中表現(xiàn)出高度靈活性，并配備圖像確認功能，使整個操作過程更加可靠和可控。
 
B.SIGHT系統(tǒng)占地面積小，能夠方便地放置在厭氧室和層流罩中進行實驗，這進一步增強了其應用范圍和適應性。利用B.SIGHT，已經(jīng)成功獲得了2800個單克隆的培養(yǎng)物。
 
盡管本文的研究重點是腸道微生物群，但通過適當調(diào)整培養(yǎng)條件，這一方法也可以便捷地應用于其他類型的微生物環(huán)境。因此，這種高通量培養(yǎng)工作流程被視為研究并培養(yǎng)復雜微生物種群快速且有效的方法，不僅提高了實驗的效率和產(chǎn)出質(zhì)量，還為多種微生物的研究提供了強大工具，為相關(guān)科學研究奠定了堅實基礎(chǔ)。
 
B.SIGHT用戶案例
經(jīng)典的瓊脂平板（CAP）方法雖然廣泛用于研究微生物群落，但其耗時頗長。相比之下，單細胞分配（SCD）方法則允許高通量、無標記地分選微生物。德國亞琛工業(yè)大學研究團隊借助B.SIGHT系統(tǒng)開發(fā)了一種新的厭氧SCD方案，用于培養(yǎng)人類腸道細菌，并通過糞便樣本在三種富營養(yǎng)培養(yǎng)基上，與CAP方法進行了對比。實驗結(jié)果顯示，新的厭氧SCD方法將單克隆培養(yǎng)物的獲得時間從17天縮短至5天，同時其分離細菌的多樣性和相對豐度在覆蓋率與CAP方法相當。
 
此外，研究團隊還測試了總捕獲部分，對2400個分配的單細胞在生長后直接進行測序，分析未標識單個菌株的體積生物量。結(jié)果顯示，SCD方法的培養(yǎng)分數(shù)從35.2%提升至52.2%，展示了單樣本在深層培養(yǎng)項目中的潛力。基于SCD的培養(yǎng)還獲得了未檢測到的物種，每個樣本平均發(fā)現(xiàn)16種未知微生物，其中包括7個新分類群。
 
此研究覆蓋了5個門（放線菌門、擬桿菌門、脫硫菌門、厚壁菌門和變形菌門）、24個科的82種人類腸道細菌，其中包含11個新屬和10個新物種的第一個培養(yǎng)菌。這為微生物培養(yǎng)和研究提供了新的視角和方法。  
未來展望
B.SIGHT技術(shù)在厭氧腸道細菌分離工作中帶來了革命性的變化。憑借其高效、精準和高通量的特性，B.SIGHT不僅顯著提升了研究效率，還為合成生物學和微生物組學的研究開辟了新的可能性。這一突破性工具無疑為相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供了充分的便利和潛力。如果您也從事相關(guān)領(lǐng)域的研究，B.SIGHT絕對是您值得嘗試的強大工具。它不僅能加速您的研究進展，還能為您提供更為精確和可靠的實驗結(jié)果。
 
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