多組學測序分析揭示m5C甲基化上調E2F1表達以促進卵巢癌腫瘤進展
卵巢癌是全球死亡率最高的婦科癌癥，其中上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌類型。由于缺乏可靠的卵巢癌早期篩查，導致診斷延遲，5年生存率僅為50%。盡管近些年來治療技術取得了進展，但由于其發(fā)病機制的基因調控網絡不明確，卵巢癌的預后仍然很差。最近的研究表明，RNA修飾與疾�。òò┌Y）發(fā)生和發(fā)展密切相關。5-甲基胞嘧啶（m5C）是一種常見的RNA修飾，其在轉錄后水平調控基因表達，但m5C RNA修飾與生物分子凝聚以及轉錄因子介導的轉錄調控之間的交互作用，在卵巢癌中的了解還很有限。
近期，重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產中心易萍教授團隊揭示了RNA甲基轉移酶NSUN2促進mRNA m5C修飾，并與轉錄因子E2F1在卵巢癌中形成正反饋調控回路（positive feedback regulatory loop）。具體來說，NSUN2促進E2F1 mRNA m5C修飾并增加其穩(wěn)定性，而E2F1與NSUN2啟動子相結合，又反過來激活NSUN2轉錄。RNA結合蛋白YBX1作為m5C reader，參與NSUN2介導的E2F1調控。m5C修飾促進YBX1相分離，從而上調E2F1表達。卵巢癌中的NSUN2和YBX1被擴增和上調，而NSUN2和YBX1高表達表明卵巢癌患者預后較差。此外，E2F1轉錄調控癌基因MYBL2和RAD54L表達，從而推動卵巢癌進展。本研究繪制了一個由m5C修飾以依賴于YBX1相分離的方式調控NSUN2-E2F1-NSUN2循環(huán)，這可能是卵巢癌治療的潛在靶點。相關研究成果以“RNA m5C modification upregulates E2F1 expression in a manner dependent on YBX1 phase separation and promotes tumor progression in ovarian cancer”為題發(fā)表在Nature子刊《Experimental & Molecular Medicine》上。
標題：RNA m5C修飾以依賴于YBX1相分離的方式上調E2F1表達，從而促進卵巢癌的腫瘤進展
期刊：Experimental & Molecular Medicine（Exp Mol Med）
影響因子：IF 9.5
發(fā)表時間：2024年3月1日
研究方法：
樣本選擇
2016年至2022年從重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院和大坪醫(yī)院采集獲得漿液性上皮性卵巢癌組織、輸卵管上皮（fallopian tube epithelium, FTE）組織和正常卵巢上皮組織樣本。
實驗方法
研究使用了豐富的實驗方法：
研究思路
本研究通過收集卵巢癌組織和FTE組織，分析了RNA甲基轉移酶NSUN2在卵巢癌中的表達，揭示NSUN2在卵巢癌中的過表達。通過功能獲得實驗和功能喪失實驗驗證NSUN2的致癌功能，并證實其通過調控細胞生長和細胞轉移在卵巢癌中發(fā)揮作用。免疫熒光染色和GO分析揭示NSUN2在卵巢癌細胞中的定位和腫瘤相關調控通路。此外，通過RNA-BisSeq、RNA-seq、RIP-seq和ChIP-seq等技術分析了NSUN2介導的基因表達調控，并驗證E2F1在NSUN2介導的卵巢癌進展中發(fā)揮至關重要的作用。
研究結果
（1）NSUN2在卵巢癌組織中過表達，NSUN2過表達與卵巢癌癥患者預后不良相關
為研究m5C修飾在卵巢癌癥中的作用，作者分析了14種m5C調控因子在TCGA隊列中的表達。結果表明，多種m5C調節(jié)因子在卵巢癌癥中失調，其中RNA甲基轉移酶NSUN2表達變化最為顯著，通常上調過表達。Kaplan-Meier分析顯示，NSUN2表達上調與預后不良密切相關，主要通過調控細胞增殖和轉移在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用。
圖1：NSUN2促進卵巢癌的腫瘤發(fā)生和轉移。
a. 根據GEO數(shù)據集（GSE19071、GSE18520和GSE27651），揭示NSUN2在卵巢癌中的RNA表達水平。
b. 新鮮卵巢癌組織和輸卵管上皮（FTE）組織中NSUN2蛋白的表達水平。
c. 免疫組化分析卵巢表面上皮和卵巢癌組織中NSUN2蛋白的相對表達，并展示代表性免疫組化圖像。
d. CCK-8實驗評估了NSUN2敲除對卵巢癌細胞生長的影響。
e. 集落形成實驗分析NSUN2敲除對卵巢癌細胞生長的影響。
f. Transwell遷移和侵襲實驗分析有或沒有NSUN2表達的卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力。
g–i. 通過小鼠異種移植模型分析有或沒有NSUN2表達的卵巢癌細胞的腫瘤形成能力。將NSUN2敲除型和對照OVCAR3細胞皮下注射到小鼠中。每3天檢測一次形成的腫瘤體積（h）。22天后切除形成的腫瘤（g），并檢測腫瘤重量（i）。
j-k. 異種移植切片中Ki-67和Caspase-3表達的代表性圖像和定量分析。
l-m. NSUN2敲除對卵巢癌細胞轉移的影響，并定量分析在小鼠腹腔內形成的轉移病灶。
（2）RNA-BisSeq揭示NSUN2促進卵巢癌癥細胞m5C RNA修飾
鑒于已經證實NSUN2能夠催化mRNA m5C修飾，作者首先通過免疫熒光染色檢測了 NSUN2 在卵巢癌細胞中的定位。隨后使用特異性靶向m5C修飾RNA的抗體進行斑點印跡實驗，以確認 NSUN2 是否調控整體mRNA m5C修飾。為了確定由NSUN2介導的特異性mRNA m5C修飾，作者通過RNA-BisSeq 在 NSUN2敲除后的卵巢癌細胞中全轉錄組范圍內繪制了單堿基分辨率下的m5C修飾變化。分析結果表明，NSUN2敲除后，6192個RNAs的16536個位點上的m5C修飾減少，這些m5C修飾位點被鑒定為卵巢癌細胞中的高甲基化位點。NSUN2敲除后全局m5C修飾水平也有所下降。卵巢癌細胞中m5C位點的中位甲基化百分比約為30%，大多數(shù)轉錄本的m5C百分比低于40%。約80% m5C修飾轉錄本是mRNA（圖2c）。與之前的研究結果一致，m5C位點主要在富含CG序列中富集，最富集區(qū)域是外顯子，同時非翻譯區(qū)（UTRs）和翻譯起始位點（起始C）在內的其他區(qū)域也受m5C修飾。m5C位點傾向于分布在mRNA轉錄本的5'-UTRs和起始密碼子中，與在小鼠胚胎干細胞和大腦中的發(fā)現(xiàn)一致，但在非編碼RNA轉錄本的5'和3'端富集。在對照和NSUN2敲除的卵巢癌細胞中，mRNA轉錄本中m5C位點的分布特征沒有顯著差異。對卵巢癌細胞中高甲基化m5C轉錄本的GO分析表明，與腫瘤相關的調控通路在這些轉錄本中富集。
b. 柱狀圖和箱線圖顯示有或沒有NSUN2過表達的卵巢癌細胞中mRNA m5C水平分布。
c. 不同種類RNA轉錄本中，m5C修飾位點的轉錄本所占比例。
d. HOMER算法分析顯示mRNA m5C位點相鄰序列的保守性序列標志圖(Logoplot)。
e. 在有或沒有NSUN2過表達的卵巢癌細胞中高甲基化m5C peaks的轉錄組范圍分布。餅狀圖顯示了m5C位點在不同mRNA區(qū)域（包括編碼序列CDS、內含子、5'-UTR、3'-UTR、起始密碼子和終止密碼子）中的比例。
這些數(shù)據表明NSUN2對卵巢癌細胞中mRNA的m5C修飾水平有顯著影響，且m5C修飾在mRNA的不同區(qū)域有不同的分布模式。
（3）多組學策略揭示了 NSUN2 在卵巢癌中的靶點
為進一步探索NSUN2介導的基因表達調控，作者對NSUN2敲除的卵巢癌細胞進行RNA測序（RNA-seq），并對卵巢癌細胞進行RNA結合蛋白免疫沉淀測序（RIP-seq）。測序分析結果表明，在卵巢癌細胞中，NSUN2敲除導致1744個基因表達變化，RIP-seq顯示NSUN2能夠與2842個轉錄本結合。GO分析揭示通過RNA-seq和RIP-seq鑒定的轉錄本被富集在不同的信號通路中。約72.5%的NSUN2結合轉錄本是蛋白質編碼RNA。通過對RNA-seq、RIP-seq和RNA-BisSeq數(shù)據的綜合分析，鑒定出163個轉錄本作為NSUN2的潛在靶點（圖3d）。
為進一步確定NSUN2介導的基因調控機制，使用比值比（OR）來評估m(xù)5C高甲基化RNA或NSUN2結合轉錄本與NSUN2敲除卵巢癌細胞中差異表達基因（DEGs）之間的相關性。結果顯示m5C修飾的RNA和NSUN2結合的RNA在NSUN2敲除后傾向下調表達，表明NSUN2正向調控其靶標基因的表達。通過累積分析揭示卵巢癌細胞中m5C高甲基化的RNA在NSUN2敲除后同樣下調，NSUN2結合親和力高的RNA也表現(xiàn)出m5C高甲基化，在NSUN2敲除細胞中表達降低。GO分析顯示163個候選NSUN2標靶中，81個下調基因在與轉錄調控相關的通路中富集。因此，這些數(shù)據表明NSUN2能夠促進mRNA的m5C修飾，并正向調控其表達。
b. 點陣圖顯示NSUN2結合的轉錄本。對NSUN2進行RIP-seq后，通過斑點印跡實驗分析input組和IP組的基因計數(shù)。
c. 分析NSUN2結合轉錄本類型。
d. RNA-BisSeq（m5C）、RNA-seq（RNA）和NSUN2 RIP-seq（RIP）數(shù)據鑒定的RNA重疊維恩圖。
e. 上圖：計算比值比公式。下圖：NSUN2敲除后，NSUN2結合與非結合轉錄本以及高甲基化m5C峰轉錄本DEGs比值比。
f. 累積曲線圖顯示NSUN2沉默后卵巢癌細胞中高甲基化m5C峰變化。
g. 累積曲線圖顯示卵巢癌細胞中高甲基化m5C峰對NSUN2結合的作用。
h. 累積曲線圖揭示NSUN2沉默后卵巢癌細胞中NSUN2結合轉錄本的變化。
i. 對NSUN2敲除細胞中81個下調基因進行GO功能富集分析。
j. 根據多組學綜合分析結果，卵巢癌細胞中NSUN2的關鍵標靶熱圖。
k. 基于GO分析的37個NSUN2關鍵標靶的功能性注釋。外環(huán)粉紅色表示與轉錄相關術語。
l. Metagene圖顯示NSUN2敲除以及NSUN2結合時卵巢癌細胞中m5C位點和RNA豐度分布。
m. RT-qPCR檢測NSUN2敲除后A2780細胞中NSUN2標靶的RNA水平。
n. RIP-PCR評估NSUN2與其標靶轉錄本之間的互作。
為縮小卵巢癌細胞中NSUN2靶標范圍，在NSUN2敲除后的SKOV3細胞中進行了RNA-seq測序，并通過生物信息學分析鑒定出1748個基因被NSUN2敲除顯著調控。在這些卵巢癌細胞系中，差異表達基因（DEGs）之間表現(xiàn)出中等程度相關性，且這些DEGs與m5C高甲基化轉錄本和NSUN2結合的轉錄本也有重疊。通過對SKOV3細胞中726個下調的轉錄本、被NSUN2占據的下調轉錄本、以及A2780細胞中m5C修飾的轉錄本綜合分析，鑒定出37個基因作為NSUN2的關鍵靶標。對這些靶標基因的功能注釋分析顯示，主要是與轉錄相關的術語在這些基因中富集，這與上述在A2780卵巢癌細胞中靶標功能分析結果一致。在這些候選基因中選擇一組與腫瘤形成相關的基因來驗證NSUN2的調控效應。由RNA-BisSeq確定的m5C位點以及由RNA-seq確定的RNA表達譜，通過RT-qPCR和RIP-PCR檢測驗證NSUN2敲除后靶標基因表達變化以及NSUN2與這些基因互作。
（4）NSUN2和YBX1以m5C依賴性方式調控E2F1 mRNA穩(wěn)定性
圖4：E2F1表達受NSUN2和YBX1以m5C依賴性方式調控。
a. 卵巢癌NSUN2敲低細胞E2F1蛋白表達的Western Blot分析。
b. m5C-RIP實驗后，RT-qPCR驗證NSUN2介導E2F1 mRNA m5C修飾。
c. 在NSUN2敲除卵巢癌細胞中評估E2F1 mRNA半衰期。
d. 帶有FLAG標簽的野生型NSUN2和催化活性缺失的NSUN2示意圖。
e. RIP-PCR實驗驗證NSUN2及其突變體與E2F1 mRNA的互作。
f. 在共表達NSUN2或NSUN2突變體的細胞中，檢測并比較攜帶野生型E2F1 3'-UTR或m5C位點缺失的E2F13'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因，并將其歸一化為Renilla熒光素酶活性。
g. 在對照和NSUN2敲除的卵巢癌細胞中，檢測并比較攜帶野生型E2F1 3'-UTR或m5C位點缺失的E2F1 3'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因。
h. 在卵巢癌細胞中YBX1缺失后檢測了E2F1表達。
i. YBX1敲除對卵巢癌細胞中E2F1 mRNA半衰期的影響。
j. YBX1敲除對SKOV3細胞中E2F1 mRNA半衰期的影響。
k. RIP-PCR結果驗證YBX1與E2F1 mRNA的相互作用。
l. 在對照和YBX1缺失的卵巢癌細胞中，檢測并比較攜帶野生型E2F1 3'-UTR或m5C位點缺失的E2F1 3'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因，并將其歸一化為Renilla熒光素酶活性。
m. 在共表達YBX1的HEK293T細胞中，檢測并比較攜帶野生型E2F1 3'-UTR或m5C位點缺失的E2F1 3'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因，并將其歸一化為Renilla熒光素酶活性。
（5）YBX1在卵巢癌中經歷相分離并上調
YBX1在卵巢癌細胞中經歷液相分離，可以形成液滴結構并調控受m5C修飾的RNA命運。NSUN2敲除破壞YBX1液滴形成，而m5C修飾的RNA可以增強YBX1液相分離。
b. 對(a)中所示的FRAP檢測結果進行定量分析。
c. YBX1免疫熒光成像顯示，在NSUN2敲除后卵巢癌細胞形成YBX斑點。
d. YBX1蛋白與m5C修飾RNA或非m5C修飾RNA的相分離。
e. 對GFP融合的YBX1及不同YBX1突變體的免疫熒光成像。
f. 共表達YBX1或其突變體的HEK293T細胞中，檢測并歸一化了攜帶野生型E2F1 3'-UTR或帶有m5C位點缺失的E2F1 3'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因。
g. 結合RNA FISH和免疫熒光(IF)用于檢測E2F1 mRNA與YBX1凝聚體的共定位。
h. 根據GSE27651數(shù)據集，卵巢癌樣本中YBX1的RNA表達。
i. CPTAC數(shù)據集中卵巢癌組織和輸卵管上皮(FTE)組織中YBX1的蛋白表達。
j. Hu隊列中卵巢癌和FTE組織中YBX1的蛋白表達。
k. YBX1表達與卵巢癌患者總生存期和無進展生存期的關聯(lián)Kaplan-Meier分析。
（6）ChIP-seq等揭示E2F1轉錄調控NSUN2表達
b. E2F1缺失卵巢癌細胞的NSUN2 RNA水平。
c. E2F1過表達卵巢癌細胞的NSUN2蛋白表達。
d. E2F1過表達卵巢癌細胞的NSUN2 RNA水平。
e. ChIP-seq實驗結果證實E2F1與卵巢癌細胞NSUN2啟動子之間的相互作用。
f. 在HEK293T和SKOV3細胞中，檢測E2F1過表達或敲除的NSUN2啟動子相對熒光素酶活性報告基因，并將該活性歸一化為Renilla熒光素酶活性。
g. 卵巢癌細胞中NSUN2敲除后MYBL2和RAD54L表達變化熱圖。
h. 卵巢癌細胞中E2F1或NSUN2表達喪失后，驗證了MYBL2和RAD54L RNA水平。
j. YBX1調控卵巢癌細胞中MYBL2和RAD54L表達。
k. 在對照和NSUN2敲除的A2780卵巢癌細胞中進行E2F1 ChIP-seq實驗，以檢測NSUN2是否影響E2F1在MYBL2和RAD54L啟動子處的富集。
l. 在對照和NSUN2敲除的OVCAR3和SKOV3細胞中進行E2F1 ChIP-seq實驗，以檢測NSUN2是否影響E2F1與MYBL2和RAD54L啟動子的結合。
（7）E2F1與NSUN2的腫瘤促進功能密切相關
為進一步驗證E2F1在NSUN2介導的卵巢癌進展中的影響，作者在NSUN2敲除的卵巢癌細胞中進行挽救試驗。
b. CCK-8實驗結果表明，強制表達E2F1促進NSUN2敲除的卵巢癌細胞生長。
c. 在NSUN2敲除的卵巢癌細胞中重新表達E2F1促進細胞集落形成。
d-e. 強制表達E2F1對NSUN2缺失的卵巢癌細胞遷移和侵襲的作用。
f-h. 利用小鼠異種移植模型評估了有或沒有NSUN2過表達后再過表達E2F1的卵巢癌細胞腫瘤生長情況，并對形成的腫瘤體積和重量進行檢測。
i. 評估有或沒有NSUN2過表達后再過表達E2F1的卵巢癌細胞轉移到小鼠腹腔的情況。
j. 分析NSUN2與E2F1、NSUN2與MYBL2、NSUN2與RAD54L之間的表達相關性，以及E2F1與MYBL2和E2F1與RAD54L之間的表達相關性。
k. 通過組織芯片分析，對卵巢癌患者（n=134）中NSUN2與E2F1蛋白表達之間的Spearman等級相關性進行分析。
l. 提出卵巢癌NSUN2-E2F1調控網絡模型。
易小結
本研究通過豐富的實驗，既有體外和體內實驗相結合，同時又結合多組學（RNA-BisSeq、RNA-seq、RIP-seq和ChIP-seq等技術）研究分析。揭示了RNA甲基轉移酶NSUN2在卵巢癌中高表達，預示著不良預后。E2F1可以調控NSUN2轉錄，NSUN2轉錄增多，促進了腫瘤細胞的m5C甲基化，RNA m5C修飾以依賴于YBX1相分離的方式上調E2F1表達。E2F1的mRNA m5C甲基化，被相分離形成聚合的YBX1結合，維持E2F1穩(wěn)定性，促進E2F1表達，激活腫瘤增殖。從而形成 NSUN2-E2F1-NSUN2 正反饋回路，為卵巢癌治療提供有前途的靶點。
主要發(fā)現(xiàn)：
參考文獻：
Liu X, Wei Q, Yang C, Zhao H, Xu J, Mobet Y, Luo Q, Yang D, Zuo X, Chen N, Yang Y, Li L, Wang W, Yu J, Xu J, Liu T, Yi P. RNA m5C modification upregulates E2F1 expression in a manner dependent on YBX1 phase separation and promotes tumor progression in ovarian cancer. Exp Mol Med. 2024 Mar 1. pii: 10.1038/s12276-024-01184-4. doi: 10.1038/s12276-024-01184-4. PubMed PMID: 38424195.
近期，重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產中心易萍教授團隊揭示了RNA甲基轉移酶NSUN2促進mRNA m5C修飾，并與轉錄因子E2F1在卵巢癌中形成正反饋調控回路（positive feedback regulatory loop）。具體來說，NSUN2促進E2F1 mRNA m5C修飾并增加其穩(wěn)定性，而E2F1與NSUN2啟動子相結合，又反過來激活NSUN2轉錄。RNA結合蛋白YBX1作為m5C reader，參與NSUN2介導的E2F1調控。m5C修飾促進YBX1相分離，從而上調E2F1表達。卵巢癌中的NSUN2和YBX1被擴增和上調，而NSUN2和YBX1高表達表明卵巢癌患者預后較差。此外，E2F1轉錄調控癌基因MYBL2和RAD54L表達，從而推動卵巢癌進展。本研究繪制了一個由m5C修飾以依賴于YBX1相分離的方式調控NSUN2-E2F1-NSUN2循環(huán)，這可能是卵巢癌治療的潛在靶點。相關研究成果以“RNA m5C modification upregulates E2F1 expression in a manner dependent on YBX1 phase separation and promotes tumor progression in ovarian cancer”為題發(fā)表在Nature子刊《Experimental & Molecular Medicine》上。
標題：RNA m5C修飾以依賴于YBX1相分離的方式上調E2F1表達，從而促進卵巢癌的腫瘤進展
期刊：Experimental & Molecular Medicine（Exp Mol Med）
影響因子：IF 9.5
發(fā)表時間：2024年3月1日
研究方法：
樣本選擇
2016年至2022年從重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院和大坪醫(yī)院采集獲得漿液性上皮性卵巢癌組織、輸卵管上皮（fallopian tube epithelium, FTE）組織和正常卵巢上皮組織樣本。
實驗方法
研究使用了豐富的實驗方法：
- 前期實驗：多種細胞培養(yǎng)、腫瘤樣本分析、質粒轉染、慢病毒轉導、蛋白表達和純化、體外相分離實驗、熒光恢復后光漂白（FRAP）實驗、Western Blot分析、細胞增殖實驗、Transwell實驗、斑點印跡實驗、免疫熒光（IF）和RNA熒光原位雜交（RNA-FISH）；
- 多組學測序相互印證：RNA測序（RNA-seq）、RNA免疫沉淀和高通量測序（RIP-seq）、RNA亞硫酸鹽測序（RNA-BisSeq）、染色質免疫沉淀（ChIP）和ChIP-seq；（易基因優(yōu)勢技術）
- 下游驗證：增強UV交聯(lián)免疫沉淀后PCR（eCLIP-PCR）、RNA半衰期檢測、熒光素酶報告基因分析、Polysome分析。
研究思路
本研究通過收集卵巢癌組織和FTE組織，分析了RNA甲基轉移酶NSUN2在卵巢癌中的表達，揭示NSUN2在卵巢癌中的過表達。通過功能獲得實驗和功能喪失實驗驗證NSUN2的致癌功能，并證實其通過調控細胞生長和細胞轉移在卵巢癌中發(fā)揮作用。免疫熒光染色和GO分析揭示NSUN2在卵巢癌細胞中的定位和腫瘤相關調控通路。此外，通過RNA-BisSeq、RNA-seq、RIP-seq和ChIP-seq等技術分析了NSUN2介導的基因表達調控，并驗證E2F1在NSUN2介導的卵巢癌進展中發(fā)揮至關重要的作用。
研究結果
（1）NSUN2在卵巢癌組織中過表達，NSUN2過表達與卵巢癌癥患者預后不良相關
為研究m5C修飾在卵巢癌癥中的作用，作者分析了14種m5C調控因子在TCGA隊列中的表達。結果表明，多種m5C調節(jié)因子在卵巢癌癥中失調，其中RNA甲基轉移酶NSUN2表達變化最為顯著，通常上調過表達。Kaplan-Meier分析顯示，NSUN2表達上調與預后不良密切相關，主要通過調控細胞增殖和轉移在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用。
圖1：NSUN2促進卵巢癌的腫瘤發(fā)生和轉移。
b. 新鮮卵巢癌組織和輸卵管上皮（FTE）組織中NSUN2蛋白的表達水平。
c. 免疫組化分析卵巢表面上皮和卵巢癌組織中NSUN2蛋白的相對表達，并展示代表性免疫組化圖像。
d. CCK-8實驗評估了NSUN2敲除對卵巢癌細胞生長的影響。
e. 集落形成實驗分析NSUN2敲除對卵巢癌細胞生長的影響。
f. Transwell遷移和侵襲實驗分析有或沒有NSUN2表達的卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力。
g–i. 通過小鼠異種移植模型分析有或沒有NSUN2表達的卵巢癌細胞的腫瘤形成能力。將NSUN2敲除型和對照OVCAR3細胞皮下注射到小鼠中。每3天檢測一次形成的腫瘤體積（h）。22天后切除形成的腫瘤（g），并檢測腫瘤重量（i）。
j-k. 異種移植切片中Ki-67和Caspase-3表達的代表性圖像和定量分析。
l-m. NSUN2敲除對卵巢癌細胞轉移的影響，并定量分析在小鼠腹腔內形成的轉移病灶。
（2）RNA-BisSeq揭示NSUN2促進卵巢癌癥細胞m5C RNA修飾
鑒于已經證實NSUN2能夠催化mRNA m5C修飾，作者首先通過免疫熒光染色檢測了 NSUN2 在卵巢癌細胞中的定位。隨后使用特異性靶向m5C修飾RNA的抗體進行斑點印跡實驗，以確認 NSUN2 是否調控整體mRNA m5C修飾。為了確定由NSUN2介導的特異性mRNA m5C修飾，作者通過RNA-BisSeq 在 NSUN2敲除后的卵巢癌細胞中全轉錄組范圍內繪制了單堿基分辨率下的m5C修飾變化。分析結果表明，NSUN2敲除后，6192個RNAs的16536個位點上的m5C修飾減少，這些m5C修飾位點被鑒定為卵巢癌細胞中的高甲基化位點。NSUN2敲除后全局m5C修飾水平也有所下降。卵巢癌細胞中m5C位點的中位甲基化百分比約為30%，大多數(shù)轉錄本的m5C百分比低于40%。約80% m5C修飾轉錄本是mRNA（圖2c）。與之前的研究結果一致，m5C位點主要在富含CG序列中富集，最富集區(qū)域是外顯子，同時非翻譯區(qū)（UTRs）和翻譯起始位點（起始C）在內的其他區(qū)域也受m5C修飾。m5C位點傾向于分布在mRNA轉錄本的5'-UTRs和起始密碼子中，與在小鼠胚胎干細胞和大腦中的發(fā)現(xiàn)一致，但在非編碼RNA轉錄本的5'和3'端富集。在對照和NSUN2敲除的卵巢癌細胞中，mRNA轉錄本中m5C位點的分布特征沒有顯著差異。對卵巢癌細胞中高甲基化m5C轉錄本的GO分析表明，與腫瘤相關的調控通路在這些轉錄本中富集。
圖2：NSUN2介導卵巢癌細胞中的mRNA m5C修飾。
a. 斑點印跡圖顯示了卵巢癌細胞中NSUN2敲除后整體mRNA m5C修飾變化。b. 柱狀圖和箱線圖顯示有或沒有NSUN2過表達的卵巢癌細胞中mRNA m5C水平分布。
c. 不同種類RNA轉錄本中，m5C修飾位點的轉錄本所占比例。
d. HOMER算法分析顯示mRNA m5C位點相鄰序列的保守性序列標志圖(Logoplot)。
e. 在有或沒有NSUN2過表達的卵巢癌細胞中高甲基化m5C peaks的轉錄組范圍分布。餅狀圖顯示了m5C位點在不同mRNA區(qū)域（包括編碼序列CDS、內含子、5'-UTR、3'-UTR、起始密碼子和終止密碼子）中的比例。
這些數(shù)據表明NSUN2對卵巢癌細胞中mRNA的m5C修飾水平有顯著影響，且m5C修飾在mRNA的不同區(qū)域有不同的分布模式。
（3）多組學策略揭示了 NSUN2 在卵巢癌中的靶點
為進一步探索NSUN2介導的基因表達調控，作者對NSUN2敲除的卵巢癌細胞進行RNA測序（RNA-seq），并對卵巢癌細胞進行RNA結合蛋白免疫沉淀測序（RIP-seq）。測序分析結果表明，在卵巢癌細胞中，NSUN2敲除導致1744個基因表達變化，RIP-seq顯示NSUN2能夠與2842個轉錄本結合。GO分析揭示通過RNA-seq和RIP-seq鑒定的轉錄本被富集在不同的信號通路中。約72.5%的NSUN2結合轉錄本是蛋白質編碼RNA。通過對RNA-seq、RIP-seq和RNA-BisSeq數(shù)據的綜合分析，鑒定出163個轉錄本作為NSUN2的潛在靶點（圖3d）。
為進一步確定NSUN2介導的基因調控機制，使用比值比（OR）來評估m(xù)5C高甲基化RNA或NSUN2結合轉錄本與NSUN2敲除卵巢癌細胞中差異表達基因（DEGs）之間的相關性。結果顯示m5C修飾的RNA和NSUN2結合的RNA在NSUN2敲除后傾向下調表達，表明NSUN2正向調控其靶標基因的表達。通過累積分析揭示卵巢癌細胞中m5C高甲基化的RNA在NSUN2敲除后同樣下調，NSUN2結合親和力高的RNA也表現(xiàn)出m5C高甲基化，在NSUN2敲除細胞中表達降低。GO分析顯示163個候選NSUN2標靶中，81個下調基因在與轉錄調控相關的通路中富集。因此，這些數(shù)據表明NSUN2能夠促進mRNA的m5C修飾，并正向調控其表達。
圖3：轉錄組范圍鑒定NSUN2標靶。
a. 與對照A2780細胞相比，NSUN2敲除細胞中差異表達基因（DEGs）熱圖。b. 點陣圖顯示NSUN2結合的轉錄本。對NSUN2進行RIP-seq后，通過斑點印跡實驗分析input組和IP組的基因計數(shù)。
c. 分析NSUN2結合轉錄本類型。
d. RNA-BisSeq（m5C）、RNA-seq（RNA）和NSUN2 RIP-seq（RIP）數(shù)據鑒定的RNA重疊維恩圖。
e. 上圖：計算比值比公式。下圖：NSUN2敲除后，NSUN2結合與非結合轉錄本以及高甲基化m5C峰轉錄本DEGs比值比。
f. 累積曲線圖顯示NSUN2沉默后卵巢癌細胞中高甲基化m5C峰變化。
g. 累積曲線圖顯示卵巢癌細胞中高甲基化m5C峰對NSUN2結合的作用。
h. 累積曲線圖揭示NSUN2沉默后卵巢癌細胞中NSUN2結合轉錄本的變化。
i. 對NSUN2敲除細胞中81個下調基因進行GO功能富集分析。
j. 根據多組學綜合分析結果，卵巢癌細胞中NSUN2的關鍵標靶熱圖。
k. 基于GO分析的37個NSUN2關鍵標靶的功能性注釋。外環(huán)粉紅色表示與轉錄相關術語。
l. Metagene圖顯示NSUN2敲除以及NSUN2結合時卵巢癌細胞中m5C位點和RNA豐度分布。
m. RT-qPCR檢測NSUN2敲除后A2780細胞中NSUN2標靶的RNA水平。
n. RIP-PCR評估NSUN2與其標靶轉錄本之間的互作。
為縮小卵巢癌細胞中NSUN2靶標范圍，在NSUN2敲除后的SKOV3細胞中進行了RNA-seq測序，并通過生物信息學分析鑒定出1748個基因被NSUN2敲除顯著調控。在這些卵巢癌細胞系中，差異表達基因（DEGs）之間表現(xiàn)出中等程度相關性，且這些DEGs與m5C高甲基化轉錄本和NSUN2結合的轉錄本也有重疊。通過對SKOV3細胞中726個下調的轉錄本、被NSUN2占據的下調轉錄本、以及A2780細胞中m5C修飾的轉錄本綜合分析，鑒定出37個基因作為NSUN2的關鍵靶標。對這些靶標基因的功能注釋分析顯示，主要是與轉錄相關的術語在這些基因中富集，這與上述在A2780卵巢癌細胞中靶標功能分析結果一致。在這些候選基因中選擇一組與腫瘤形成相關的基因來驗證NSUN2的調控效應。由RNA-BisSeq確定的m5C位點以及由RNA-seq確定的RNA表達譜，通過RT-qPCR和RIP-PCR檢測驗證NSUN2敲除后靶標基因表達變化以及NSUN2與這些基因互作。
（4）NSUN2和YBX1以m5C依賴性方式調控E2F1 mRNA穩(wěn)定性
圖4：E2F1表達受NSUN2和YBX1以m5C依賴性方式調控。
b. m5C-RIP實驗后，RT-qPCR驗證NSUN2介導E2F1 mRNA m5C修飾。
c. 在NSUN2敲除卵巢癌細胞中評估E2F1 mRNA半衰期。
d. 帶有FLAG標簽的野生型NSUN2和催化活性缺失的NSUN2示意圖。
e. RIP-PCR實驗驗證NSUN2及其突變體與E2F1 mRNA的互作。
f. 在共表達NSUN2或NSUN2突變體的細胞中，檢測并比較攜帶野生型E2F1 3'-UTR或m5C位點缺失的E2F13'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因，并將其歸一化為Renilla熒光素酶活性。
g. 在對照和NSUN2敲除的卵巢癌細胞中，檢測并比較攜帶野生型E2F1 3'-UTR或m5C位點缺失的E2F1 3'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因。
h. 在卵巢癌細胞中YBX1缺失后檢測了E2F1表達。
i. YBX1敲除對卵巢癌細胞中E2F1 mRNA半衰期的影響。
j. YBX1敲除對SKOV3細胞中E2F1 mRNA半衰期的影響。
k. RIP-PCR結果驗證YBX1與E2F1 mRNA的相互作用。
l. 在對照和YBX1缺失的卵巢癌細胞中，檢測并比較攜帶野生型E2F1 3'-UTR或m5C位點缺失的E2F1 3'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因，并將其歸一化為Renilla熒光素酶活性。
m. 在共表達YBX1的HEK293T細胞中，檢測并比較攜帶野生型E2F1 3'-UTR或m5C位點缺失的E2F1 3'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因，并將其歸一化為Renilla熒光素酶活性。
（5）YBX1在卵巢癌中經歷相分離并上調
YBX1在卵巢癌細胞中經歷液相分離，可以形成液滴結構并調控受m5C修飾的RNA命運。NSUN2敲除破壞YBX1液滴形成，而m5C修飾的RNA可以增強YBX1液相分離。
圖5：YBX1冷凝（condensation）調控E2F1表達。
a. 熒光恢復的代表性圖像。b. 對(a)中所示的FRAP檢測結果進行定量分析。
c. YBX1免疫熒光成像顯示，在NSUN2敲除后卵巢癌細胞形成YBX斑點。
d. YBX1蛋白與m5C修飾RNA或非m5C修飾RNA的相分離。
e. 對GFP融合的YBX1及不同YBX1突變體的免疫熒光成像。
f. 共表達YBX1或其突變體的HEK293T細胞中，檢測并歸一化了攜帶野生型E2F1 3'-UTR或帶有m5C位點缺失的E2F1 3'-UTR的相對熒光素酶活性報告基因。
g. 結合RNA FISH和免疫熒光(IF)用于檢測E2F1 mRNA與YBX1凝聚體的共定位。
h. 根據GSE27651數(shù)據集，卵巢癌樣本中YBX1的RNA表達。
i. CPTAC數(shù)據集中卵巢癌組織和輸卵管上皮(FTE)組織中YBX1的蛋白表達。
j. Hu隊列中卵巢癌和FTE組織中YBX1的蛋白表達。
k. YBX1表達與卵巢癌患者總生存期和無進展生存期的關聯(lián)Kaplan-Meier分析。
（6）ChIP-seq等揭示E2F1轉錄調控NSUN2表達
圖6：E2F1轉錄調控NSUN2表達。
a. E2F1缺失卵巢癌細胞的NSUN2蛋白豐度。b. E2F1缺失卵巢癌細胞的NSUN2 RNA水平。
c. E2F1過表達卵巢癌細胞的NSUN2蛋白表達。
d. E2F1過表達卵巢癌細胞的NSUN2 RNA水平。
e. ChIP-seq實驗結果證實E2F1與卵巢癌細胞NSUN2啟動子之間的相互作用。
f. 在HEK293T和SKOV3細胞中，檢測E2F1過表達或敲除的NSUN2啟動子相對熒光素酶活性報告基因，并將該活性歸一化為Renilla熒光素酶活性。
g. 卵巢癌細胞中NSUN2敲除后MYBL2和RAD54L表達變化熱圖。
h. 卵巢癌細胞中E2F1或NSUN2表達喪失后，驗證了MYBL2和RAD54L RNA水平。
j. YBX1調控卵巢癌細胞中MYBL2和RAD54L表達。
k. 在對照和NSUN2敲除的A2780卵巢癌細胞中進行E2F1 ChIP-seq實驗，以檢測NSUN2是否影響E2F1在MYBL2和RAD54L啟動子處的富集。
l. 在對照和NSUN2敲除的OVCAR3和SKOV3細胞中進行E2F1 ChIP-seq實驗，以檢測NSUN2是否影響E2F1與MYBL2和RAD54L啟動子的結合。
（7）E2F1與NSUN2的腫瘤促進功能密切相關
為進一步驗證E2F1在NSUN2介導的卵巢癌進展中的影響，作者在NSUN2敲除的卵巢癌細胞中進行挽救試驗。
圖7：E2F1異位表達減輕了NSUN2缺失對卵巢癌的抑制作用。
a. NSUN2敲除卵巢癌細胞中重新表達E2F1時的E2F1表達情況Western Blot分析。b. CCK-8實驗結果表明，強制表達E2F1促進NSUN2敲除的卵巢癌細胞生長。
c. 在NSUN2敲除的卵巢癌細胞中重新表達E2F1促進細胞集落形成。
d-e. 強制表達E2F1對NSUN2缺失的卵巢癌細胞遷移和侵襲的作用。
f-h. 利用小鼠異種移植模型評估了有或沒有NSUN2過表達后再過表達E2F1的卵巢癌細胞腫瘤生長情況，并對形成的腫瘤體積和重量進行檢測。
i. 評估有或沒有NSUN2過表達后再過表達E2F1的卵巢癌細胞轉移到小鼠腹腔的情況。
j. 分析NSUN2與E2F1、NSUN2與MYBL2、NSUN2與RAD54L之間的表達相關性，以及E2F1與MYBL2和E2F1與RAD54L之間的表達相關性。
k. 通過組織芯片分析，對卵巢癌患者（n=134）中NSUN2與E2F1蛋白表達之間的Spearman等級相關性進行分析。
l. 提出卵巢癌NSUN2-E2F1調控網絡模型。
易小結
本研究通過豐富的實驗，既有體外和體內實驗相結合，同時又結合多組學（RNA-BisSeq、RNA-seq、RIP-seq和ChIP-seq等技術）研究分析。揭示了RNA甲基轉移酶NSUN2在卵巢癌中高表達，預示著不良預后。E2F1可以調控NSUN2轉錄，NSUN2轉錄增多，促進了腫瘤細胞的m5C甲基化，RNA m5C修飾以依賴于YBX1相分離的方式上調E2F1表達。E2F1的mRNA m5C甲基化，被相分離形成聚合的YBX1結合，維持E2F1穩(wěn)定性，促進E2F1表達，激活腫瘤增殖。從而形成 NSUN2-E2F1-NSUN2 正反饋回路，為卵巢癌治療提供有前途的靶點。
主要發(fā)現(xiàn)：
- RNA甲基轉移酶NSUN2促進m5C修飾E2F1 mRNA，增加其穩(wěn)定性。
- E2F1與NSUN2啟動子結合，反過來激活NSUN2轉錄，形成正反饋調控回路。
- RNA結合蛋白YBX1作為m5C reader，參與NSUN2介導的E2F1調控。
- m5C修飾促進YBX1相分離，進而上調E2F1表達。
參考文獻：
Liu X, Wei Q, Yang C, Zhao H, Xu J, Mobet Y, Luo Q, Yang D, Zuo X, Chen N, Yang Y, Li L, Wang W, Yu J, Xu J, Liu T, Yi P. RNA m5C modification upregulates E2F1 expression in a manner dependent on YBX1 phase separation and promotes tumor progression in ovarian cancer. Exp Mol Med. 2024 Mar 1. pii: 10.1038/s12276-024-01184-4. doi: 10.1038/s12276-024-01184-4. PubMed PMID: 38424195.
標簽：
DNA甲基化
