膜片鉗技術(shù)的發(fā)展歷史與應(yīng)用簡介

膜片鉗技術(shù)簡介

離子通道的生理學(xué)一直是神經(jīng)科學(xué)家感興趣的一個重要話題。誕生于1970年代的膜片鉗技術(shù)開啟了電生理學(xué)家的新時代。它不僅可以對整個細胞進行高分辨率電流記錄，還可以對切下的細胞膜片進行高分辨率電流記錄。甚至可以研究單通道事件。然而，由于需要復(fù)雜且高靈敏的設(shè)備，廣泛的生物學(xué)背景和高水平的實驗技能，電生理學(xué)仍然是最具挑戰(zhàn)性的實驗室方法之一。
 

歷史背景

從18世紀(jì)路易吉·伽伐尼（Luigi Galvani）的開創(chuàng)性工作開始，到19世紀(jì)埃米爾·杜布瓦-雷蒙德（Emil du Bois-Reymond）、約翰內(nèi)斯·彼得·穆勒（Johannes Peter Müller）和赫爾曼·馮·亥姆霍茲（Hermann von Helmholtz）的工作，質(zhì)膜和細胞的興奮性一直是神經(jīng)系統(tǒng)研究的主要興趣^[1]。艾倫·勞埃德·霍奇金（Alan Lloyd Hodgkin）和安德魯·赫胥黎（Andrew Huxley）在1952年使用電壓鉗技術(shù)揭示了動作電位的離子通道事件，并于1963年因其杰出的工作而獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎^[2,3]。

那時，電壓鉗僅能用于相當(dāng)大的細胞，因為需要鋒利的微電極來穿透質(zhì)膜。在1970年代末，貝爾特·薩克曼（Bert Sakmann）和埃爾文·內(nèi)爾（Erwin Neher）改進了電壓鉗技術(shù)，并且首次解析了青蛙骨骼肌膜片上的單離子通道電流。他們因此榮膺1991年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎^[4,5]。下一個突破則是貝爾特·薩克曼（Bert Sakmann）在1980年發(fā)明的高阻封接，極大地提高了信噪比，并允許記錄更小的電流^[6]。

電生理學(xué)，最初誕生在特殊的生物物理實驗室，現(xiàn)在已經(jīng)擴展到基礎(chǔ)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，并成為研究神經(jīng)系統(tǒng)中單個細胞或整個細胞網(wǎng)絡(luò)行為的最重要工具之一。

 

膜片鉗技術(shù)的一般原理

圖1：膜片鉗記錄的一般原理：含有電解質(zhì)溶液的玻璃管緊密封接到細胞膜上，從而實現(xiàn)膜片的電隔離。因此流經(jīng)該膜片中離子通道的電流會流入微電極，然后通過鏈接到高靈敏度差分放大器的電極進行記錄。在電壓鉗配置中，電流通過負反饋環(huán)路注入細胞，以補償細胞膜電位的變化。記錄該電流可以得出有關(guān)細胞膜電導(dǎo)性的結(jié)論。

膜片鉗技術(shù)可以研究若干，甚至單個離子通道^[7]。因此，它引起了興奮類細胞研究工作的極大興趣，例如神經(jīng)元、心肌細胞和肌纖維。^[8]

單個離子通道每秒可以傳導(dǎo)約1000萬個離子。不過，電流僅有幾皮安。記錄這種數(shù)量級的電流不僅對研究人員，對于設(shè)備而言同樣極具挑戰(zhàn)。原理是將帶有鈍端的薄玻璃或石英管密封在膜上（參見圖1、2和3）。

施加吸力可以產(chǎn)生千兆歐姆級別的高阻抗封接。這種緊密封接可以對膜片進行電隔離，這意味著流過膜片的所有離子都會流入微電極，并借助連接到高靈敏度電子放大器的氯化銀線電極（(Ag/AgCl)電極）記錄。浴電極用于設(shè)置零電平。

為了防止細胞膜電位發(fā)生變化，放大器會產(chǎn)生類似于流經(jīng)細胞膜電流的補償電流，作為負反饋機制（參見圖1）。

測量細胞的膜電位并將其與指令電位進行比較。如果指令電位和測量值之間存在差異，則會注入電流。該補償電流將記錄下來，并可以得出有關(guān)膜電導(dǎo)的結(jié)論。膜電位可以獨立于離子電流進行操縱，這種能力可以研究膜通道的電流-電壓關(guān)系。

圖2：微電極貼附到培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細胞膜的相差圖像。圖片來自德國波鴻魯爾大學(xué)的Ainhara Aguado博士提供。
 

膜片鉗配置

根據(jù)研究對象，可以使用不同的配置。在細胞貼附模式下，膜片保持完整（參見圖3）。松散貼片是細胞貼附模式的修改版。這種情況下，移液器沒有緊密封接在細胞膜上，而是松散地貼附在細胞膜上。該模式通常用于記錄神經(jīng)元細胞中的動作電位。它的優(yōu)點在于細胞質(zhì)的成分不受影響。不過，另一方面，細胞內(nèi)環(huán)境無法控制。

通過電極微管施加造孔劑（通常為抗生素）會產(chǎn)生穿孔膜片來保證離子連續(xù)性，同時細胞內(nèi)蛋白質(zhì)不會被電極液洗掉。最常用的膜片鉗模式是全細胞模式（參見圖3）。要實現(xiàn)這種模式，通過短暫施加強吸力來破壞膜片。微電極內(nèi)部與細胞質(zhì)連為一體。該方法用于記錄來自整個細胞的電位和電流。對于全細胞測量方式，研究人員有兩種配置方式可供選擇：電壓鉗模式，其中電壓保持恒定并記錄電流，或者電流鉗模式，其中電流保持恒定并觀察膜電位的變化。

此外，也可以僅記錄來自小塊而不是整個細胞的電流。這增加記錄單個離子通道的機會。膜片可以根據(jù)微電極內(nèi)部的兩個不同方向確定方位。為實現(xiàn)內(nèi)面向外的配置，微電極貼附在細胞膜上，并且可以收回以撕下一小片膜（圖3）。本例中，細胞膜的胞質(zhì)表面暴露在外面。這種方法通常用于研究單個通道的活性，優(yōu)點在于可以調(diào)整暴露在細胞內(nèi)表面的培養(yǎng)基。

如果希望研究細胞外誘因（如神經(jīng)遞質(zhì)）的影響，則應(yīng)選擇外面向外的配置（參見圖3）。這種情況下，移液器在全細胞測量配置中收回，導(dǎo)致細胞膜破裂并重組。在該配置中，細胞外表面暴露，因此可以輕松應(yīng)用細胞外誘因。

 

貼片鉗的四種記錄方法

圖3：貼片鉗的四種記錄方法。細胞連接。當(dāng)移液器最接近細胞膜時，施加輕微的吸力以獲得移液器和細胞膜之間的緊密密封。全細胞。通過施加另一個短暫但強烈的吸力，細胞膜被破裂，移液管獲得進入細胞質(zhì)的機會。由內(nèi)向外：在細胞連接模式下，移液器被縮回，貼片與膜的其他部分分離，暴露在空氣中。膜的細胞質(zhì)表面被暴露出來。外側(cè)：在全細胞模式下，移液器被縮回，導(dǎo)致兩小塊膜重新連接，形成一個小的囊狀結(jié)構(gòu)，細胞膜的細胞膜面朝向移液器溶液。源于此。如果你能給我打補丁--什么是補丁夾子技術(shù)？

 

要求

膜片鉗實驗適用于培養(yǎng)細胞、急性解離細胞或者急性振動切片，從而研究細胞在其自然環(huán)境中的電生理學(xué)特性。感興趣的離子通道也可以在通用細胞系（HEK293、CHO、LNCaP）中分離并異質(zhì)表達。

根據(jù)樣品不同，需要使用倒置（培養(yǎng)細胞）或者具有穩(wěn)定平臺的正置固定載物臺顯微鏡（切片樣品）。如果要研究急性切片中的細胞，建議使用紅外DIC（微分干涉對比）顯微鏡^[9]，后者可以更加方便地觀察細胞膜。顯微鏡應(yīng)放置在防振臺上，因為任何移動都可能對微電極和細胞膜之間的封接造成致命影響。

需要使用顯微操作臂來精確移動微電極。加熱并拉長小型玻璃或石英毛細管可以形成極細的微電極管。電極管吸頭的直徑約為1微米，其中包含的膜片僅含幾個（甚至一個）離子通道。微電極管吸頭需要在熔融狀態(tài)進行熱拋光，以便在吸頭接觸到細胞膜后實現(xiàn)高阻抗封接。電極管中含有類似于胞外溶液或細胞質(zhì)的溶液，具體取決于記錄模式。微電極安裝在顯微操作臂上，可以向細胞膜精準(zhǔn)移動。

為了檢測電流，使用了氯化銀線。同樣采用氯化銀線（作為銀/氯化銀電極）的浴電極設(shè)置為零電流值。帶低噪聲晶體管的差分放大器連接到計算機，以進行數(shù)據(jù)采集和數(shù)字化，可以采購特定軟件來控制該放大器并分析數(shù)據(jù)�；蛘�，可以使用示波器來監(jiān)測電流。如有需要，可以為該配置添加灌注系統(tǒng)。特定物質(zhì)可以通過灌注筆或使用POC（灌注開關(guān)）室添加。

參考文獻：

1.Areles Molleman, Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology, John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, England, (2003)

2.Bertil Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, Sinauer Associates Inc. (2001)

了解更多：徠卡顯微