入射光熒光顯微鏡的發(fā)展歷史

圖 3：熒光外延照明需要一個二向色鏡（灰色），它能夠?qū)⒓ぐl(fā)光（藍(lán)色）反射到試樣上，并將發(fā)射光（綠色）傳遞到檢測端。激發(fā)光的波長可通過相應(yīng)的濾光片（橙色）進(jìn)行預(yù)選。朝向檢測側(cè)的濾光片（紫色）只允許熒光團(tuán)的波長通過，并排除激發(fā)光的殘余雜散光。

遺憾的是，由于鐵幕之間缺乏信息交流，Ploem 并不知道俄羅斯的發(fā)展情況。盡管如此，他還是自己開始使用二向色分光鏡。針對 Ploem 的特殊情況，他與著名的特種玻璃生產(chǎn)商肖特公司（美因茨）共同開發(fā)了一種可反射藍(lán)光和綠光的分光鏡（Ploem，1965 年）。之后，他用 Leitz 公司提供的中性分光鏡改裝了一臺 "Opak" 外延照明器，通過引入一個帶有四個不同二向色分光鏡的滑塊，他可以在紫外線、紫光、藍(lán)光和綠光之間非常快速、方便地改變激發(fā)光的波長（Ploem，1967 年）（圖 4）。

圖 4：熒光多波長外延照明器，帶有四個安裝在滑塊中的二向色分光鏡，用于紫外、紫光、藍(lán)光和綠光的入射照明。由阿姆斯特丹大學(xué)制造（Ploem，1965 年）。

熒光濾光器立方體

開發(fā)二向色分光鏡以產(chǎn)生不同波長的激發(fā)光具有重要的優(yōu)勢。當(dāng)時，紫外光譜（約 100 nm - 380 nm）的激發(fā)光非常普遍，但卻有一個惱人的副作用：自發(fā)熒光。很多組織物質(zhì)都會被紫外線激發(fā)，從而產(chǎn)生微弱的背景光（圖 5）。通過將二向色鏡的反射波長調(diào)整到綠色或藍(lán)色范圍，Ploem 能夠達(dá)到當(dāng)時非常常用的兩種熒光染料 FITC（494 納米）和 TRITC（541 納米）的激發(fā)最大值，而不會產(chǎn)生自發(fā)熒光。FITC（異硫氰酸熒光素）和 TRITC（四甲基羅丹明-5（和 6）-異硫氰酸酯）可與抗體耦合，目前仍用于免疫熒光顯微鏡。通過在較小范圍內(nèi)達(dá)到其激發(fā)最大值，組織標(biāo)本的對比度得到了顯著增強(qiáng)（圖 5）。使用 Ploem 的二向色分光器產(chǎn)生的激發(fā)光束能有效地與 FITC 的激發(fā)最大值相匹配，即使是發(fā)射光譜很差的光源也能使用。

圖 5：左圖：用寬波段紫外激發(fā)光照射標(biāo)記有免疫標(biāo)記（FITC）的組織細(xì)胞。注意帶有藍(lán)色自發(fā)熒光的組織結(jié)構(gòu)。右圖 使用窄波段藍(lán)光（490 納米）外延照明，對相同的組織和相同的 FITC 標(biāo)記進(jìn)行免疫染色。注意圖像對比度的增加（Ploem，1967 年）。

有鑒于此，現(xiàn)在可以利用外延照明的優(yōu)勢，使用普通的高壓汞弧光燈提供藍(lán)光和綠光的窄帶激發(fā)。這一改進(jìn)滿足了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)�熒光顯微鏡的需求。

根據(jù) Ploem 的發(fā)明，Leitz 設(shè)計出了一種新型多波長熒光外延照明器，它帶有四個旋轉(zhuǎn)式二向色分光鏡，可在紫外、紫光、藍(lán)光和綠光范圍內(nèi)激發(fā)標(biāo)本，這就是 Leitz PLOEMOPAK。

萊茨員工卡夫（W. Kraft）取得了更大的成就，他將二向色分光器與適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射濾光器組合在一個工件上，即所謂的濾光器立方體或濾光器塊（卡夫，1969 年和卡夫，1972 年）（圖 6）。他的研究成果是設(shè)計出了一種外延照明器，該照明器帶有多組四個這樣的濾光器立方體，如今幾乎所有的多波長熒光顯微鏡都是以這些濾光器立方體為基礎(chǔ)的。