Nature子刊文獻解讀：中山大學團隊解析平衡易位如何引發(fā)罕見眼部疾病
隨著新一代測序技術在臨床上的廣泛應用，單基因遺傳病的診斷率有所提高，但仍未超過50%。對于大多數未確診的患者來說，這可能是由于技術方面的缺陷，以及對大部分變異的功能性后果不甚了解，特別是位于非編碼區(qū)的變異。
短讀長測序方法在解析結構變異上能力有限，尤其是復雜的結構變異（包括倒位和易位）。長讀長測序技術雖提高了結構變異的鑒定能力，但變異解讀仍然存在很大挑戰(zhàn)，特別是帶有非編碼斷裂點的平衡結構變異。對于基因間區(qū)域的變異，需要基因水平和功能分析兩方面的證據，才能確認這些變異的致病性。
近日，中山大學中山眼科中心和中山醫(yī)學院的研究人員探究了一種罕見眼部疾�。ㄖ醒牒缒ぐl(fā)育不全）的遺傳基礎。他們發(fā)現(xiàn)，非編碼區(qū)的結構變異通過破壞三維基因組結構導致基因表達發(fā)生變化，從而引發(fā)這種孟德爾遺傳病。這項研究成果于2024年6月13日發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員對大家族中的6名患者和6名正常個體進行了全基因組連鎖分析，并通過精細定位和單倍型分析確認致病基因的位置。他們利用短讀長和長讀長測序平臺尋找致病變異，并利用患者的外周血單核細胞構建iPSC，利用Hi-C測序、CUT&Tag和RNA-seq分析來探究平衡易位導致眼組織缺損的機制。之后，他們還利用增強子敲除的iPSC（由賽業(yè)生物提供）和斑馬魚模型來驗證APCDD1基因的作用。
技術路線
研究結果
1. 對中央虹膜發(fā)育不全家族的遺傳分析
中山眼科中心接診了一名出生后出現(xiàn)畏光癥狀的患者，發(fā)現(xiàn)其雙眼僅虹膜瞳孔區(qū)中央缺失，瞳孔假性增大。研究人員發(fā)現(xiàn)，這種中央虹膜發(fā)育不全（central iris hypoplasia）在其大家族中表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳模式。此次共有12名家族成員參與研究，包括6名患病個體和6名正常個體。其余5名患者也存在畏光史和類似的虹膜缺損。
研究人員隨后對12名個體的基因組DNA進行了全基因組連鎖掃描，將標記定位在6號和18號染色體。精細定位和單倍型分析證實這兩個基因座分別位于6q15-q23.3和18p11.31-q12.1上。接下來，他們利用短讀長測序平臺對4名患者和2名正常個體開展了全外顯子組測序和/或全基因組測序分析，但這兩種方法都未能在連鎖間隔內發(fā)現(xiàn)任何致病的單核苷酸變異（SNP）或插入缺失（InDel）。
為了探索潛在的結構變異，研究人員利用長讀長的Nanopore平臺對一名患者進行了基因組測序，發(fā)現(xiàn)了一個之前未發(fā)現(xiàn)的平衡易位t(6;18)(q22.31;p11.22)（圖1）。另一名患者的熒光原位雜交和核型分析也證實了這一易位變異。該變異的兩個斷裂點均位于基因間區(qū)域，且Sanger測序證實這兩個斷裂點存在于6名患者中，而不存在于正常個體中（圖1）。
2.易位導致染色質三維結構重建
為了進一步探索平衡易位導致中央虹膜發(fā)育不全的分子機制，研究人員對1名患者和1名對照的外周血單核細胞進行了重編程，生成了誘導多能干細胞（iPSC）。他們對兩名個體的iPSC樣本開展Hi-C測序、CUT&Tag和RNA-seq分析。他們發(fā)現(xiàn)，在正常個體中，易位的兩個斷裂點分別位于6號染色體和18號染色體上的兩個染色質拓撲關聯(lián)結構域（TAD）中，且這兩個TAD中存在增強子簇。
然而，在患者樣本中，易位破壞了這兩個TAD，導致染色質的斷裂點附近形成了新的TAD（圖2）。最重要的是，在新的TAD中，易位導致上述增強子簇與APCDD1啟動子之間發(fā)生異位相互作用。通過RNA-seq定量附近基因的表達變化后，他們發(fā)現(xiàn)僅有APCDD1的表達變化具有統(tǒng)計學意義，且定量PCR和Western分析證實了這一點（圖2）。這些結果表明，易位導致染色質三維結構重建，造成組織特異性增強子異位，引起APCDD1基因表達上調。
為了驗證異位增強子簇與APCDD1過表達之間的關聯(lián)，研究人員委托賽業(yè)生物構建了敲除增強子的患者iPSC細胞（圖3）。RT-qPCR結果顯示，與未敲除增強子的iPSC相比，敲除增強子的iPSC細胞中APCDD1 RNA的過表達得到部分挽救（圖3）。這一結果表明，APCDD1 與增強子之間的異位染色質相互作用是導致APCDD1上調的潛在機制。
3.APCDD1在虹膜發(fā)育中發(fā)揮作用
那么，APCDD1在虹膜中發(fā)揮什么作用？免疫熒光染色的結果表明，APCDD1在虹膜前緣層和基質中特異性表達，表明它在虹膜結構維持中發(fā)揮作用。通過對不同階段胚胎小鼠的眼睛進行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)Apcdd1在E11.5至E14.5階段在神經視網膜的外周內層表達，而在E17.5階段局限于睫狀體和視網膜的交界處。這些結果表明它可能在小鼠睫狀體邊緣帶的發(fā)育中發(fā)揮作用，也支持APCDD1在人類虹膜中發(fā)揮作用。
最后，他們還利用斑馬魚模型驗證了這一結果。當斑馬魚幼魚過表達人類APCDD1的旁系同源基因時，近一半的幼魚出現(xiàn)了眼組織缺損表型，明顯高于對照。免疫染色顯示，兩組過表達apcdd1的幼魚的眼部胚裂區(qū)基底膜出現(xiàn)明顯分離，胚裂閉合失敗導致幼魚眼組織缺損。這些結果進一步證實了APCDD1在虹膜發(fā)育中的作用。
結論
這項研究在一個大家族中發(fā)現(xiàn)了一種獨特的表型——中央虹膜發(fā)育不全，這是一種常染色體顯性性狀。全基因組連鎖掃描、基因組測序、Hi-C等分析表明，這種表型是由非編碼區(qū)的平衡易位t(6;18)(q22.31;p11.22)引起的，它導致基因組三維結構發(fā)生改變，使得APCDD1的增強子和啟動子之間發(fā)生異常相互作用，從而造成該基因表達上調。
研究人員認為，這項研究證明了非編碼結構變異在遺傳性疾病中的潛在作用。他們希望利用這種方法來闡明非編碼變異如何導致其他遺傳病，未來的研究重點是探索染色質三維結構的改變如何影響基因表達。
原文檢索
Sun, W., Xiong, D., Ouyang, J. et al. Altered chromatin topologies caused by balanced chromosomal translocation lead to central iris hypoplasia. Nat Commun 15, 5048 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-49376-w
本文摘自：https://www.cyagen.cn/articles/AE000718
短讀長測序方法在解析結構變異上能力有限，尤其是復雜的結構變異（包括倒位和易位）。長讀長測序技術雖提高了結構變異的鑒定能力，但變異解讀仍然存在很大挑戰(zhàn)，特別是帶有非編碼斷裂點的平衡結構變異。對于基因間區(qū)域的變異，需要基因水平和功能分析兩方面的證據，才能確認這些變異的致病性。
近日，中山大學中山眼科中心和中山醫(yī)學院的研究人員探究了一種罕見眼部疾�。ㄖ醒牒缒ぐl(fā)育不全）的遺傳基礎。他們發(fā)現(xiàn)，非編碼區(qū)的結構變異通過破壞三維基因組結構導致基因表達發(fā)生變化，從而引發(fā)這種孟德爾遺傳病。這項研究成果于2024年6月13日發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員對大家族中的6名患者和6名正常個體進行了全基因組連鎖分析，并通過精細定位和單倍型分析確認致病基因的位置。他們利用短讀長和長讀長測序平臺尋找致病變異，并利用患者的外周血單核細胞構建iPSC，利用Hi-C測序、CUT&Tag和RNA-seq分析來探究平衡易位導致眼組織缺損的機制。之后，他們還利用增強子敲除的iPSC（由賽業(yè)生物提供）和斑馬魚模型來驗證APCDD1基因的作用。
技術路線
在接診眼部畏光的患者后，發(fā)現(xiàn)中央虹膜發(fā)育不全家族
↓
通過全基因組連鎖分析和精細作圖等確認致病基因的位置
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利用長讀長測序平臺發(fā)現(xiàn)平衡易位，并利用Hi-C測序等分析探究分子機制
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利用增強子敲除的iPSC和斑馬魚模型驗證APCDD1基因的作用
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通過全基因組連鎖分析和精細作圖等確認致病基因的位置
↓
利用長讀長測序平臺發(fā)現(xiàn)平衡易位，并利用Hi-C測序等分析探究分子機制
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利用增強子敲除的iPSC和斑馬魚模型驗證APCDD1基因的作用
研究結果
1. 對中央虹膜發(fā)育不全家族的遺傳分析
中山眼科中心接診了一名出生后出現(xiàn)畏光癥狀的患者，發(fā)現(xiàn)其雙眼僅虹膜瞳孔區(qū)中央缺失，瞳孔假性增大。研究人員發(fā)現(xiàn)，這種中央虹膜發(fā)育不全（central iris hypoplasia）在其大家族中表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳模式。此次共有12名家族成員參與研究，包括6名患病個體和6名正常個體。其余5名患者也存在畏光史和類似的虹膜缺損。
研究人員隨后對12名個體的基因組DNA進行了全基因組連鎖掃描，將標記定位在6號和18號染色體。精細定位和單倍型分析證實這兩個基因座分別位于6q15-q23.3和18p11.31-q12.1上。接下來，他們利用短讀長測序平臺對4名患者和2名正常個體開展了全外顯子組測序和/或全基因組測序分析，但這兩種方法都未能在連鎖間隔內發(fā)現(xiàn)任何致病的單核苷酸變異（SNP）或插入缺失（InDel）。
為了探索潛在的結構變異，研究人員利用長讀長的Nanopore平臺對一名患者進行了基因組測序，發(fā)現(xiàn)了一個之前未發(fā)現(xiàn)的平衡易位t(6;18)(q22.31;p11.22)（圖1）。另一名患者的熒光原位雜交和核型分析也證實了這一易位變異。該變異的兩個斷裂點均位于基因間區(qū)域，且Sanger測序證實這兩個斷裂點存在于6名患者中，而不存在于正常個體中（圖1）。
圖1. 家族患者中存在平衡易位t(6;18)(q22.31;p11.22)
2.易位導致染色質三維結構重建
為了進一步探索平衡易位導致中央虹膜發(fā)育不全的分子機制，研究人員對1名患者和1名對照的外周血單核細胞進行了重編程，生成了誘導多能干細胞（iPSC）。他們對兩名個體的iPSC樣本開展Hi-C測序、CUT&Tag和RNA-seq分析。他們發(fā)現(xiàn)，在正常個體中，易位的兩個斷裂點分別位于6號染色體和18號染色體上的兩個染色質拓撲關聯(lián)結構域（TAD）中，且這兩個TAD中存在增強子簇。
然而，在患者樣本中，易位破壞了這兩個TAD，導致染色質的斷裂點附近形成了新的TAD（圖2）。最重要的是，在新的TAD中，易位導致上述增強子簇與APCDD1啟動子之間發(fā)生異位相互作用。通過RNA-seq定量附近基因的表達變化后，他們發(fā)現(xiàn)僅有APCDD1的表達變化具有統(tǒng)計學意義，且定量PCR和Western分析證實了這一點（圖2）。這些結果表明，易位導致染色質三維結構重建，造成組織特異性增強子異位，引起APCDD1基因表達上調。
圖2. 平衡易位導致染色質三維結構重建和基因表達改變
為了驗證異位增強子簇與APCDD1過表達之間的關聯(lián)，研究人員委托賽業(yè)生物構建了敲除增強子的患者iPSC細胞（圖3）。RT-qPCR結果顯示，與未敲除增強子的iPSC相比，敲除增強子的iPSC細胞中APCDD1 RNA的過表達得到部分挽救（圖3）。這一結果表明，APCDD1 與增強子之間的異位染色質相互作用是導致APCDD1上調的潛在機制。
圖3. 增強子區(qū)域的敲除部分挽救了APCDD1的過表達
3.APCDD1在虹膜發(fā)育中發(fā)揮作用
那么，APCDD1在虹膜中發(fā)揮什么作用？免疫熒光染色的結果表明，APCDD1在虹膜前緣層和基質中特異性表達，表明它在虹膜結構維持中發(fā)揮作用。通過對不同階段胚胎小鼠的眼睛進行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)Apcdd1在E11.5至E14.5階段在神經視網膜的外周內層表達，而在E17.5階段局限于睫狀體和視網膜的交界處。這些結果表明它可能在小鼠睫狀體邊緣帶的發(fā)育中發(fā)揮作用，也支持APCDD1在人類虹膜中發(fā)揮作用。
最后，他們還利用斑馬魚模型驗證了這一結果。當斑馬魚幼魚過表達人類APCDD1的旁系同源基因時，近一半的幼魚出現(xiàn)了眼組織缺損表型，明顯高于對照。免疫染色顯示，兩組過表達apcdd1的幼魚的眼部胚裂區(qū)基底膜出現(xiàn)明顯分離，胚裂閉合失敗導致幼魚眼組織缺損。這些結果進一步證實了APCDD1在虹膜發(fā)育中的作用。
結論
這項研究在一個大家族中發(fā)現(xiàn)了一種獨特的表型——中央虹膜發(fā)育不全，這是一種常染色體顯性性狀。全基因組連鎖掃描、基因組測序、Hi-C等分析表明，這種表型是由非編碼區(qū)的平衡易位t(6;18)(q22.31;p11.22)引起的，它導致基因組三維結構發(fā)生改變，使得APCDD1的增強子和啟動子之間發(fā)生異常相互作用，從而造成該基因表達上調。
研究人員認為，這項研究證明了非編碼結構變異在遺傳性疾病中的潛在作用。他們希望利用這種方法來闡明非編碼變異如何導致其他遺傳病，未來的研究重點是探索染色質三維結構的改變如何影響基因表達。
原文檢索
Sun, W., Xiong, D., Ouyang, J. et al. Altered chromatin topologies caused by balanced chromosomal translocation lead to central iris hypoplasia. Nat Commun 15, 5048 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-49376-w
本文摘自：https://www.cyagen.cn/articles/AE000718
