使用染料PHK 26進(jìn)行體外細(xì)胞的標(biāo)記和追蹤

• 隨著全球老齡化趨勢加劇，肌肉減少癥已成為重大的公共衛(wèi)生問題。肌肉減少癥是一種進(jìn)行性、廣泛性的骨骼肌疾病，是指隨著年齡增長而導(dǎo)致的骨骼肌質(zhì)量和功能的損失。

• 枸杞，在中國又稱為“枸杞子”，是一種傳統(tǒng)中藥，可以增強肌肉和骨骼的結(jié)構(gòu)和功能。此外，先前的研究表明，植物衍生的外泌體類納米顆�？梢栽诓煌�的衰老或疾病模型中發(fā)揮良好的生物活性作用。
• 該研究探索了枸杞衍生納米囊泡 (GqDNV) 在對抗與年齡相關(guān)的肌肉萎縮方面的潛力。作者成功利用 PKH 26 (紅色熒光，MedChemExpress) 染料推進(jìn)研究，并取得了顯著成果！  

 
提取 GqDNV

首先，采用超速離心和密度梯度離心相結(jié)合的方法，從新鮮枸杞 (寧杞 7 號) 中提取 GqDNV (圖 1)。

其次，通過 NTA (Nanoparticle tracking analysi, 納米顆粒跟蹤分析) 和透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) GqDNV 為細(xì)胞外囊泡，呈“杯盤”狀，大小為 127.8±1.3 nm (圖 2)。
 

圖 2. GqDNVs 的的透射電鏡圖^[1]。

 
此外，研究人員還利用 C2C12 細(xì)胞，測試了 C2C12 細(xì)胞中的細(xì)胞活力、ATP和線粒體膜電位。
 
02
他們?nèi)绾卫��?PKH 26 進(jìn)行細(xì)胞研究？

PKH 26 是一種紅色熒光染料，可與細(xì)胞膜的脂質(zhì)區(qū)域結(jié)合。它能夠發(fā)出紅色熒光 (Ex/Em=551/567 nm)，因此成為體外細(xì)胞標(biāo)記和追蹤研究的重要工具。

在細(xì)胞攝取試驗中，他們使用 PKH 26 (紅色熒光，MedChemExpress) 跟蹤 GqDNV 的細(xì)胞內(nèi)吞過程。此外，C2C12 細(xì)胞的細(xì)胞骨架用異硫氰酸熒光素 (FITC) 鬼筆環(huán)肽 (Phalloidin) (綠色熒光) 顯示，細(xì)胞核用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (藍(lán)色熒光) 標(biāo)記。同時，還使用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù) (Fluorescence activated Cell Sorting, FACS) 來測量 C2C12 細(xì)胞攝取 PKH 26 標(biāo)記的 GqDNV 的數(shù)量。  

PKH 26 跟蹤 GqDNV 的細(xì)胞內(nèi)吞過程

(1) GqDNVs 用 PKH 26（紅色熒光，MedChemExpress）標(biāo)記。
(2) 將 PKH 26 溶解于二甲基亞砜 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 中，得到 1 mM PKH 26 儲備溶液。用 PBS 以 1:100 稀釋儲備溶液，得到 10 μM 工作溶液。
(3) 將 GqDNVs 與工作溶液在室溫下孵育 30 min，然后在 150,000×g下超速離心 1.5 h，得到 PKH 26 標(biāo)記的 GqDNVs。
(4) 將 PKH 26 標(biāo)記的 GqDNVs 與 C2C12 細(xì)胞在 37 °C 黑暗條件下孵育 6 h。孵育后，收獲細(xì)胞并用 PBS 清洗以去除游離顆粒。 
(5) C2C12 細(xì)胞的細(xì)胞骨架用異硫氰酸熒光素 (FITC) 鬼筆環(huán)肽 (Phalloidin) (綠色熒光) 標(biāo)記，細(xì)胞核用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (藍(lán)色熒光) 標(biāo)記。這些染料能夠有效準(zhǔn)確地追蹤 GqDNV 的細(xì)胞內(nèi)吞過程。
(6) 通過點掃描激光共聚焦 (FV3000) 觀察 C2C12 細(xì)胞對 GqDNVs 的內(nèi)吞作用。

圖 3. C2C12 細(xì)胞和 GqDNVs 的熒光共聚焦顯微鏡圖^[1]。
PKH 26 標(biāo)記 GqDNVs (紅色熒光)；FITC 染色 C2C12 細(xì)胞骨架 (綠色熒光)；DAPI 染色 C2C12 細(xì)胞核 (藍(lán)色熒光)；合并圖是三個熒光圖像的重合圖。

 
FACS 測量 ：C2C12 細(xì)胞攝取 PKH 26 標(biāo)記的 GqDNVs 的數(shù)量

(1) 將 C2C12 細(xì)胞接種在含有 2 mL 培養(yǎng)基的 6 孔板中，分為三組 (空白組、陽性組和 GqDNVs)。
(2) 將 C2C12 細(xì)胞在空白組 (PBS)、陽性組 (10 μM PKH 26) 和 GqDNVs 組 (PKH 26 標(biāo)記的 GqDNVs) 中孵育 6 h。
(3) 使用全光譜分析流式細(xì)胞術(shù) (ID 7000) 測量具有陽性熒光的 C2C12 細(xì)胞的數(shù)量。

實驗結(jié)果

流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）顯示熒光陽性的 C2C12 細(xì)胞數(shù)量為 56％ (圖 4)。

圖 4. FACS 分選后 PKH 26 標(biāo)記的 GqDNVs 處理的 C2C12 細(xì)胞中熒光陽性細(xì)胞數(shù)量的代表^[1]。
a：PBS 處理的 C2C12 細(xì)胞 (空白組)。b：PKH 26 標(biāo)記的 C2C12 細(xì)胞 (陽性組)。c：PKH 26 標(biāo)記的 GqDNVs 處理的 C2C12 細(xì)胞 (GqDNVs 組)。a-c：縱坐標(biāo) (Events) 上的數(shù)字表示細(xì)胞數(shù)。橫坐標(biāo)顯示熒光強度。圖上的百分比表示熒光陽性的 C2C12 細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

 
該研究的其他主要發(fā)現(xiàn)：

• GqDNVs 可以促進(jìn) Dexamethasone 給藥的 C2C12 細(xì)胞中肌管的直徑。

• GqDNV 影響肌肉中成肌因子 5 (MYF5)、肌生成素 (MYOG) 和成肌分化 (MYOD) 蛋白的表達(dá)水平，這與 AMPK/SIRT1/PGC1α 通路相關(guān)。

• 本研究還檢測了 GqDNVs 在小鼠體內(nèi)的分布情況，發(fā)現(xiàn) GqDNVs 注射到小鼠股四頭肌后，能夠被肌肉吸收。 
• GqDNVs 能減輕 Dexamethasone 引起的小鼠骨骼肌萎縮,改善小鼠骨骼肌功能。在肌萎縮模型小鼠中,肌肉注射 GqDNVs 可增加股四頭肌的橫截面積、握力及 AMPK/SIRT1/PGC1α 通路的表達(dá)。

• 此外，股四頭肌能量靶向代謝組分析表明，GqDNVs 上調(diào)氨基糖和核苷酸糖的代謝、自噬和氧化磷酸化過程，從而激活肌肉再生。