MP應(yīng)用：定量表征蛋白質(zhì)-DNA間的相互作用
蛋白質(zhì)-DNA相互作用在DNA修復(fù)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等活細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用1。然而，使用傳統(tǒng)的生物分析工具研究這些相互作用時(shí)通常是比較困難的，這是因?yàn)樵撓嗷プ饔弥猩婕傲烁叨犬愘|(zhì)復(fù)合物的形成2。質(zhì)量光度法則非常適合此類相互作用體系的研究，它可以快速測(cè)量溶液中不同生物分子（例如DNA和蛋白質(zhì)）的質(zhì)量，并且無需標(biāo)記和固定2。通過表征生物分子的質(zhì)量分布，該方法詳細(xì)表征溶液中的各個(gè)蛋白質(zhì)和DNA組分，他們形成的復(fù)合物，以及每種組分的相對(duì)豐度，并且也能夠定量給出相互作用體系的親和力。此外，使用Refeyn專有的新型多功能MassGlass CC 玻片，使質(zhì)量光度法測(cè)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用變得更加容易（圖1）。該玻片消除了測(cè)量不同樣品需要手動(dòng)修飾玻片的過程，MassGlass CC 玻片有助于在單次質(zhì)量光度測(cè)量中測(cè)量實(shí)驗(yàn)中的高度異質(zhì)復(fù)合物，節(jié)省了用戶的時(shí)間，并且降低了不同批次實(shí)驗(yàn)帶來的差異。
圖1. 不同生物分子與MassGlass CC玻片相互作用示意圖。
質(zhì)量光度法需要生物分子與玻片表面發(fā)生相互作用；然而，帶有強(qiáng)烈負(fù)電荷的核酸分子往往被未修飾玻片排斥，這導(dǎo)致核酸分子與玻片的結(jié)合頻率較低，并且往往是瞬時(shí)的，這導(dǎo)致質(zhì)量光度測(cè)定數(shù)據(jù)中的結(jié)合事件比較少，并且定義不是很準(zhǔn)確。Mass Glass CC玻片具有陽離子表面電荷，有利于蛋白質(zhì)和核酸與玻片表面的相互作用，從而可以在單次測(cè)量時(shí)同時(shí)測(cè)量蛋白質(zhì)和DNA分子以及他們形成的復(fù)合物。為了展示MassGlass CC如何簡(jiǎn)化用戶的工作流程，我們使用這些玻片進(jìn)行了一系列的質(zhì)量光度測(cè)定實(shí)驗(yàn)，該研究涉及端粒重復(fù)結(jié)合因子2（TRF2）與雙鏈端粒DNA之間的相互作用。TRF2抑制DNA損傷反應(yīng)并起到保持端粒完整性的功能3,4，這時(shí)TRF2:DNA的表征尤為重要，幫助科學(xué)家們更深入了解這些生物學(xué)過程以及他們與衰老相關(guān)疾病中端粒功能障礙的關(guān)系。使用TwoMP質(zhì)量光度計(jì)和Mass Glass CC玻片，我們定量測(cè)量了參與反應(yīng)的每種組分及它們形成復(fù)合物的相對(duì)豐度，并計(jì)算了該相互作用中的平衡解離常數(shù)（KD）。蛋白質(zhì)-DNA相互作用的表征質(zhì)量光度法非常適合研究相互作用和復(fù)合物的形成。在所展示的案例研究中，TRF2以150nM和端粒DNA以1:1的比例混合，并在室溫下孵育15分鐘，使復(fù)合物的反應(yīng)達(dá)到平衡。孵育后，通過在樣品孔的原位稀釋樣品測(cè)量樣品，樣品的終濃度為15nM。結(jié)果清楚顯示了TRF2二聚體（126kDa），DNA(53kDa)以及他們相互作用形成的復(fù)合物（194kDa）（圖2）。
質(zhì)量光度法定量蛋白質(zhì)-DNA的相互作用親和力
為了獲得有關(guān)TRF2:DNA相互作用親和力的信息，我們使用15nM的質(zhì)量光度測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算了KD（圖2）.基于參考文獻(xiàn)5中提供的方法，假設(shè)該相互作用已達(dá)到平衡，我們根據(jù)三次質(zhì)量光度測(cè)量的平均值計(jì)算了KD，得到的結(jié)果為16.5±5.1nM；而當(dāng)前，相互作用親和力評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)SPR獲得結(jié)果（KD=14.8nM）相比，兩種方法的結(jié)果符合的非常好，具有較高的一致性。
上圖，使用質(zhì)量光度法分別測(cè)量TRF2和端粒DNA（15nM）；下圖為TRF2和端粒DNA以1:1摩爾比在150nM混合孵育，然后在15nM下使用質(zhì)量光度法測(cè)量，溶液中含有以下組分：端粒DNA（53kDa），TRF2二聚體（126kDa），以及TRF2和DNA以2:1的結(jié)合比形成的TRF2-DNA復(fù)合物。需要指出的是，該測(cè)量使用蛋白質(zhì)分子作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。質(zhì)量光度法可用于測(cè)量任何相互作用的KD值，其中前提是結(jié)合和未結(jié)合的物質(zhì)在質(zhì)量光度規(guī)定的濃度下(100pM-100nM)均可觀測(cè)到。與SPR相比，質(zhì)量光度法優(yōu)點(diǎn)是，定量確定參與DNA-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合比和相對(duì)豐度。此外，質(zhì)量光度法是無標(biāo)記的分析方法，不需要將蛋白質(zhì)分子固定，測(cè)量速度更快，并且用戶需要的專業(yè)知識(shí)更少。總結(jié)使用Refeyn提供的MassGlass CC即用型玻片，質(zhì)量光度法用戶可以在單次測(cè)量中表征蛋白質(zhì)-DNA相互作用，從而節(jié)省時(shí)間并避免批次間的差異。在此案例研究中，質(zhì)量光度法能夠表征TRF2：DNA的相互作用，得到的平衡解離常數(shù)與SPR數(shù)據(jù)一致。此外，質(zhì)量光度法還能獲得相互作用的結(jié)合計(jì)量學(xué)以及參與相互作用的組分以及他們?cè)谌芤褐行纬蓮?fù)合物的相對(duì)豐度。
圖1. 不同生物分子與MassGlass CC玻片相互作用示意圖。質(zhì)量光度法需要生物分子與玻片表面發(fā)生相互作用；然而，帶有強(qiáng)烈負(fù)電荷的核酸分子往往被未修飾玻片排斥，這導(dǎo)致核酸分子與玻片的結(jié)合頻率較低，并且往往是瞬時(shí)的，這導(dǎo)致質(zhì)量光度測(cè)定數(shù)據(jù)中的結(jié)合事件比較少，并且定義不是很準(zhǔn)確。Mass Glass CC玻片具有陽離子表面電荷，有利于蛋白質(zhì)和核酸與玻片表面的相互作用，從而可以在單次測(cè)量時(shí)同時(shí)測(cè)量蛋白質(zhì)和DNA分子以及他們形成的復(fù)合物。為了展示MassGlass CC如何簡(jiǎn)化用戶的工作流程，我們使用這些玻片進(jìn)行了一系列的質(zhì)量光度測(cè)定實(shí)驗(yàn)，該研究涉及端粒重復(fù)結(jié)合因子2（TRF2）與雙鏈端粒DNA之間的相互作用。TRF2抑制DNA損傷反應(yīng)并起到保持端粒完整性的功能3,4，這時(shí)TRF2:DNA的表征尤為重要，幫助科學(xué)家們更深入了解這些生物學(xué)過程以及他們與衰老相關(guān)疾病中端粒功能障礙的關(guān)系。使用TwoMP質(zhì)量光度計(jì)和Mass Glass CC玻片，我們定量測(cè)量了參與反應(yīng)的每種組分及它們形成復(fù)合物的相對(duì)豐度，并計(jì)算了該相互作用中的平衡解離常數(shù)（KD）。蛋白質(zhì)-DNA相互作用的表征質(zhì)量光度法非常適合研究相互作用和復(fù)合物的形成。在所展示的案例研究中，TRF2以150nM和端粒DNA以1:1的比例混合，并在室溫下孵育15分鐘，使復(fù)合物的反應(yīng)達(dá)到平衡。孵育后，通過在樣品孔的原位稀釋樣品測(cè)量樣品，樣品的終濃度為15nM。結(jié)果清楚顯示了TRF2二聚體（126kDa），DNA(53kDa)以及他們相互作用形成的復(fù)合物（194kDa）（圖2）。
質(zhì)量光度法定量蛋白質(zhì)-DNA的相互作用親和力
為了獲得有關(guān)TRF2:DNA相互作用親和力的信息，我們使用15nM的質(zhì)量光度測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算了KD（圖2）.基于參考文獻(xiàn)5中提供的方法，假設(shè)該相互作用已達(dá)到平衡，我們根據(jù)三次質(zhì)量光度測(cè)量的平均值計(jì)算了KD，得到的結(jié)果為16.5±5.1nM；而當(dāng)前，相互作用親和力評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)SPR獲得結(jié)果（KD=14.8nM）相比，兩種方法的結(jié)果符合的非常好，具有較高的一致性。
圖2. 質(zhì)量光度法定量溶液中蛋白質(zhì)，DNA和蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的質(zhì)量分布和相對(duì)豐度。
上圖，使用質(zhì)量光度法分別測(cè)量TRF2和端粒DNA（15nM）；下圖為TRF2和端粒DNA以1:1摩爾比在150nM混合孵育，然后在15nM下使用質(zhì)量光度法測(cè)量，溶液中含有以下組分：端粒DNA（53kDa），TRF2二聚體（126kDa），以及TRF2和DNA以2:1的結(jié)合比形成的TRF2-DNA復(fù)合物。需要指出的是，該測(cè)量使用蛋白質(zhì)分子作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。質(zhì)量光度法可用于測(cè)量任何相互作用的KD值，其中前提是結(jié)合和未結(jié)合的物質(zhì)在質(zhì)量光度規(guī)定的濃度下(100pM-100nM)均可觀測(cè)到。與SPR相比，質(zhì)量光度法優(yōu)點(diǎn)是，定量確定參與DNA-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合比和相對(duì)豐度。此外，質(zhì)量光度法是無標(biāo)記的分析方法，不需要將蛋白質(zhì)分子固定，測(cè)量速度更快，并且用戶需要的專業(yè)知識(shí)更少。總結(jié)使用Refeyn提供的MassGlass CC即用型玻片，質(zhì)量光度法用戶可以在單次測(cè)量中表征蛋白質(zhì)-DNA相互作用，從而節(jié)省時(shí)間并避免批次間的差異。在此案例研究中，質(zhì)量光度法能夠表征TRF2：DNA的相互作用，得到的平衡解離常數(shù)與SPR數(shù)據(jù)一致。此外，質(zhì)量光度法還能獲得相互作用的結(jié)合計(jì)量學(xué)以及參與相互作用的組分以及他們?cè)谌芤褐行纬蓮?fù)合物的相對(duì)豐度。
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