優(yōu)化Nav1.7靶向鎮(zhèn)痛藥助力揭示蜘蛛毒液衍生肽毒素脫靶效應(yīng)和改進(jìn)策略

研究目的：
探索蜘蛛毒液中 hNa_v1.7 肽抑制劑在離子通道的交叉活性及揭示其潛在機(jī)制，從三個(gè)不同的蜘蛛毒素 NaSpTx 家族中選了 8 個(gè)肽，結(jié)果表明這些肽能抑制 rK_v4.2 和 rK_v4.3 通道，而抑制該通道可能導(dǎo)致嚴(yán)重心臟副作用，這給其在鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)應(yīng)用帶來挑戰(zhàn)�；�于對(duì)肽毒素與 hNa_v1.7 和 rK_v4.2/4.3 分子相互作用的了解，設(shè)計(jì)出 mGpTx1 類似物 mGpTx1-SA，提高對(duì) hNa_v1.7 的選擇性，降低對(duì) rK_v4.2/4.3 的抑制，使心臟毒性最小化，且在慢性炎癥和神經(jīng)性疼痛模型中有鎮(zhèn)痛作用。隨著 Na_v1.7 作為疼痛治療靶點(diǎn)被積極研究，本研究發(fā)現(xiàn)可能為未來藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)副作用更小的鎮(zhèn)痛藥物提供見解。

研究結(jié)果：

1. 蜘蛛毒液衍生的 Na_v1.7 抑制劑對(duì) rK_v4.2 和rK_v4.3 具有高抑制效果
研究分析蜘蛛毒液衍生肽毒素，新的 HNTX-VIIa 對(duì) hNa_v1.7 抑制活性高。這些毒素有保守半胱氨酸模式和高度同源的 3D 結(jié)構(gòu)，雖體外藥理表現(xiàn)好，但體內(nèi)有差異且高劑量有毒性。對(duì) Na_v 通道亞型有選擇性，也對(duì)心臟 K_v 通道有活性。八種毒素對(duì) rK_v4.2/4.3 抑制呈電壓依賴性。除 ProTx-II （Na_v1.7 鈉通道的選擇性阻滯劑）外，其他毒性不影響 Na_v1.7 激活和失活曲線，在亞飽和濃度下可調(diào)節(jié) rK_v4.2/4.3 電壓傳感器。

圖1. 來自 NaspTx 家族 1-3 的八種蜘蛛毒素的特性

2. rK_v4.2 S3-S4 連接子參與蜘蛛毒液衍生的hNa_v1.7 抑制劑
先前研究表明，特定連接子對(duì)毒素與 Na_v1.7 的結(jié)合具有重要作用。本研究比對(duì)人類、小鼠和大鼠的 Na_v1.7 DII 和 K_v4.2/4.3 的 S3 - S4 連接子等，發(fā)現(xiàn)相似性高且?guī)ж?fù)電荷。通過定點(diǎn)誘變分析，構(gòu)建突變測(cè)定毒素抑制效能變化，表明負(fù)殘基和側(cè)鏈長(zhǎng)度重要，研究其他毒素也顯示多個(gè)氨基酸殘基參與結(jié)合有差異，解釋了對(duì) rK_v4.2 和 rK_v4.3 的抑制具有相似性，雖連接體參與結(jié)合但不排除其他位點(diǎn)。

圖2. rK_v4.2 的 S3-S4 連接子參與了八種毒素與 rK_v4.2 的結(jié)合

3. HNTX-III 具有靶向 hNa_v1.7 和 rK_v4.2 的重疊藥效團(tuán)
分子表面分析顯示八種毒素有兩親性生物活性表面特征，以 HNTX - III 為例，評(píng)估其與 rK_v4.2 的構(gòu)效關(guān)系，結(jié)果表明特定殘基突變影響對(duì) rK_v4.2 和hNa_v1.7 的抑制作用，強(qiáng)效類似物對(duì) rK_v4.2/4.3 親和力增加，表明藥效團(tuán)幾乎重疊。

圖3. HNTX-III 與 rKv4.2 相互作用涉及的關(guān)鍵殘基

4. mGpTx1的類似物（mGpTx1-SA）與rK_v4.2/4.3 相比，hNa_v1.7 選擇性顯著提高
在探索 rK_v4.2 脫靶機(jī)制時(shí)，試圖設(shè)計(jì) HNTX - III 類似物以獲得低 rK_v4.2/4.3 活性和高 hNa_v1.7 活性的優(yōu)化肽。發(fā)現(xiàn)某些突變后選擇性變化，引入 K25A 到 HNTX - III 類似物中導(dǎo)致抑制作用和再折疊效率有變化，說明其可能不是合適模板。mGpTx1有兩個(gè)多肽 mGpTx1 - R25A 和 mGpTx1 - SA，其中 mGpTx1 - SA 對(duì) hNa_v1.7 有強(qiáng)效和選擇性活性，對(duì)其他通道影響小，提高了對(duì) hNa_v1.7 的選擇性比，且對(duì)其他 K_v 通道亞型及 Ca_v 通道抑制作用低。

圖4. mGpTx1-SA 的選擇性分析

5. mGpTx1-SA 通過降低對(duì) rK_v4.2/4.3 的抑制作用來消除心臟毒性
抑制 rK_v4.2/4.3 可能導(dǎo)致心臟毒性。實(shí)驗(yàn)表明，5μM 的 mGpTx1 延長(zhǎng)大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程（APD），改變小鼠心電圖及 RR 間期和心率等；而 mGpTx1-SA 在相同條件下無影響�？傮w數(shù)據(jù)顯示，mGpTx1-SA 不具有延長(zhǎng)心肌細(xì)胞APD的活性，說明其在降低心臟毒性方面有優(yōu)勢(shì)。

圖5. mGpTx1-SA 的心臟毒性分析

7. mGpTx1-SA 的體內(nèi)安全性得到改善
考慮到 mGpTx1-SA 對(duì)某些特定通道抑制減弱且這些通道有重要生理功能，測(cè)試其對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果顯示，高劑量（2mg/kg，為鎮(zhèn)痛有效劑量 60μg/kg 的 30 倍）的 mGpTx1-SA 不影響小鼠轉(zhuǎn)棒平衡時(shí)間、游泳時(shí)間和小腸推進(jìn)，也不影響小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中的探索和運(yùn)動(dòng)行為，表明其體內(nèi)安全性較好。

結(jié)果表明，針對(duì) hNa_v1.7 的特定蜘蛛肽毒素對(duì) rK_v4.2/4.3 的脫靶抑制可能源于其高度的序列保守性。這一發(fā)現(xiàn)有助于設(shè)計(jì) hNa_v1.7 特異性鎮(zhèn)痛藥物，以減少對(duì) rK_v4.2/4.3 的抑制、減輕相關(guān)毒性，進(jìn)而提高其在治療應(yīng)用中的適用性。