染色體顯微切割及新進(jìn)展

提要　染色體顯微切割技術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)相結(jié)合的一項(xiàng)橋梁技術(shù)。近年來(lái)，該技術(shù)在同源基因的定位和克隆的價(jià)值深受關(guān)注。本文結(jié)合顯微切割的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)其應(yīng)用和新進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

完成人類基因組計(jì)劃的全序列分析，需要構(gòu)建基因高分辨遺傳圖譜和物理圖譜，如何快速有效的獲得染色體區(qū)帶特異性的序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）及表達(dá)序列標(biāo)檢（EST），構(gòu)建克隆連鎖群，分階段有序列的完成特定區(qū)帶全序列分析，染色體顯微切割技術(shù)顯示出無(wú)可比擬的優(yōu)越性。該技術(shù)自80年代初問(wèn)世以來(lái)，通過(guò)與PCR、微克隆、FISH、DNA測(cè)序、文庫(kù)篩選、比較基因組雜交等分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，在染色病研究與診斷、文庫(kù)構(gòu)建、基因定位與克隆、以及進(jìn)化遺傳學(xué)與腫瘤遺傳學(xué)等方面的研究中取得了令人矚目的成績(jī)，并以其獨(dú)特的直接性和實(shí)用性保持其分子生物學(xué)領(lǐng)域良好的應(yīng)用前景。

　　一、歷史回顧
　　1981年，德國(guó)的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Scalenghe等[1]切割了果蠅吃得開(kāi)液腺多線期X染色體第3段的幾個(gè)片段，通過(guò)蛋白酶消化、酚抽提、EcoRI酶切進(jìn)行重組克隆。1984年染色體顯微切割應(yīng)用小氧，1986年Bates等[2]切割了人的2號(hào)染色體短臂。但當(dāng)時(shí)由于所切割的染色體DNA量少，通常要切割上百條染色體，且其文庫(kù)也只含幾百個(gè)微克隆。顯微切割技術(shù)的第一閃重在突破在于它與PCR的結(jié)合，1989年Ludecke等[3]切割了人類G顯帶染色體，結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增，使其工作量大大減小。鄧漢湘等[4]則創(chuàng)造性的設(shè)計(jì)了linker-priner粘端接頭，提高了連接效率，增高了文庫(kù)質(zhì)量。而1992年Melter等［5］在PCR擴(kuò)增過(guò)程中引入簡(jiǎn)并引物，在減少工作量的同時(shí)，還解決了探針片段受酶切位點(diǎn)限制、文庫(kù)不全和部分序列高度富集的現(xiàn)象，是染色體顯微切割領(lǐng)域的又一重大突破。

　　二、探針池或文庫(kù)質(zhì)量的控制
　　顯微切割是一項(xiàng)極其精細(xì)的工作，需要有熟練的技術(shù)和嚴(yán)格的防塵措施。通常一個(gè)好的文庫(kù)存至少覆蓋50%以上所切割的染色體區(qū)域，而且不應(yīng)存在一些片段在PCR過(guò)程中的高度富集，才能保證以后研究中能分離較多的特異性DNA片段。污染的來(lái)源可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行控制。

　　1.實(shí)驗(yàn)試劑和用具
　　實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)要保持相對(duì)無(wú)菌，實(shí)驗(yàn)操作人員要戴口罩。所用緩沖液應(yīng)用0.22μM過(guò)濾器除菌，切割針對(duì)可用紫外線照射30分鐘或干熱滅菌。盡量使用一次性無(wú)菌用品。

　　2.染色體切割玻片的制備
　　雖然切割常規(guī)G帶片段通過(guò)FISH雜交得到陽(yáng)性信號(hào)，甚至使用-20℃固定3年的細(xì)胞懸液制片也可能有滿意的結(jié)果[6]，但長(zhǎng)時(shí)間的酸固定和暴露于空氣中可造成克隆插入子片段子[7，8]。Hagng等[9]為減少冰醋酸固定細(xì)胞引起DNA降解而采用速固定和乙醇洗脫。

　　3.切割方法的選擇
　　染色體顯微切割分手工切割和激光切割法[10～13]。前者較不常用，其方法是在倒置顯微鏡上裝配切割臂，安上硅化玻璃針，找到分散良好的分裂相來(lái)切割所需染色體片段。所切割染色體片段在油室中操作則操作繁瑣，而在Eppendorf管中操作污染較多。激光切割法分三步[4]：（1）自動(dòng)澆灼：常規(guī)將所切割的染色體周圍核型及細(xì)胞核用激光澆灼；（2）手工澆灼：澆灼切割核型內(nèi)除切割區(qū)帶以外的染色體；（3）比率確定：精細(xì)切割區(qū)帶邊緣。激光能切割不太分散的分裂相，污染小，提高了成功率，但需要較高的設(shè)備條件，推廣較困難。

　　4.引物設(shè)計(jì)
　　染色體顯微切割引物分特異性引物和簡(jiǎn)并引物。特異性引物有外源性和內(nèi)源性兩種。Ludecke等將內(nèi)切割片段克隆進(jìn)puc載體，再用SamI酶切后puc上序列作特異性外源引物PCR擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物克隆到puc13中，構(gòu)建了染色體8q23-q24文庫(kù)。基因定位則常用特異性內(nèi)源性引物[15，16]，即基因組DNA的一段特性性序列。簡(jiǎn)并性引物以5%26acute;-CCGACTC-GAGNNNNNNATGTGG-3%26acute;(N=A,T,G,C各25%)[17]最為常用，它比六個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸置于3%26acute;末端[18]污染少，但簡(jiǎn)并性效果差些。簡(jiǎn)并的引物可自行擴(kuò)增[19]造成探針池和文庫(kù)的質(zhì)量下降，但由于其操作簡(jiǎn)單，免去酚仿抽提、連接等步驟，又能相對(duì)減少污染。Tokayama等采用簡(jiǎn)并寡核引物穿梭PCR（Dop-shutter-PCR）提高了探針池的特異性。

　　5.PCR擴(kuò)增周期
　　PCR大大減少了切割工作量，提高了成功率，甚至一個(gè) dNA拷貝也能擴(kuò)增成功[20]。但PCR擴(kuò)增周期增加會(huì)導(dǎo)致文庫(kù)質(zhì)量下降，而FISH信號(hào)不一定減弱[21]。只要有某些片段在PCR中稍易擴(kuò)增，就易引起這些片段的富集，Stefank等[18]在66個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn)一個(gè)克隆出現(xiàn)8次。然而另一些資料顯示，由于簡(jiǎn)并，PCR擴(kuò)增呈序列非依賴性，甚至2kbDNA模板也可擴(kuò)增出不同大小的片段，在瓊脂上無(wú)明顯條帶。

　　三、應(yīng)用
　　隨著生命科學(xué)領(lǐng)域細(xì)胞分子水平研究的深入，染色體顯微切割在人、果蠅[1]、大鼠[22]、小鼠[23～25]、豬[26]等染色體研究中都有所應(yīng)用，其應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景主要以有幾個(gè)方面。
　　1.染色體水平的研究
　　應(yīng)用顯微切割構(gòu)建的染色體特異性和染色體區(qū)帶特異性探針池，與可疑患者染色體進(jìn)行正向染色體涂染[27]，或直接切割標(biāo)記染色體，進(jìn)行反向染色體涂染，可以用于研究標(biāo)記染色體[28]，單體、三體、雙微體、易位、缺失[29]以及染色體均染區(qū)（HSR）的來(lái)源、結(jié)構(gòu)和形成機(jī)制等。Tigand等[30]用顯微切割構(gòu)建的區(qū)帶特異性探針池發(fā)現(xiàn)脊髓發(fā)育不良病人中有5q-;而Engelen等[31]發(fā)現(xiàn)了5個(gè)斷裂點(diǎn)的染色體復(fù)雜重排。染色體顯微切割在染色體病產(chǎn)前診斷[32]與產(chǎn)后分析中發(fā)揮了重要的作用[33]。

　　2.分子水平的研究
　�。�1）構(gòu)建染色體特異性和區(qū)帶異性文庫(kù)
　　染色體顯微切割、PCR得到的探針長(zhǎng)度通常為150～1500bp，一般可以用來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒gDNA文庫(kù)[34]。而Hozier等[35]將cDNA原位雜交與染色體顯微切割結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建了鼠4號(hào)染色體C3-7區(qū)帶文庫(kù)。1996年 Yokoyama等[36]從胎腦mRNA反轉(zhuǎn)錄合成了第一鏈cDNA，再用兩步擴(kuò)增法—Dop-shutter-PCR合成短片段cDNA，雜交于包括兩個(gè)近端著絲粒的K562細(xì)胞系中期分裂相，再切割標(biāo)記染色體，發(fā)現(xiàn)81.5%克隆來(lái)源于所切割的相應(yīng)區(qū)域，8個(gè)單拷貝序列中有5個(gè)是新的cDNA序列，僅1個(gè)來(lái)自于非切割區(qū)。應(yīng)用顯微切割所構(gòu)建的探針池也可通過(guò)文庫(kù)篩選快速分離區(qū)帶特異性文庫(kù)[37]Abdel等[38]則分離構(gòu)建了包括700個(gè)Cosmid的12號(hào)染色體區(qū)帶特異性Cosmid亞文庫(kù)。

　�。�2）構(gòu)建整條染色體重疊群
　　關(guān)等[21]切割了人類6號(hào)染色體13個(gè)彼此相鄰的不同區(qū)帶探針池，由此構(gòu)建了6號(hào)染色體重疊群。

　　（3）構(gòu)建DNA圖譜
　　STS和EST為DNA制圖中一種重要的物理界標(biāo)。人類基因組計(jì)劃原定目標(biāo)是獲得分布于整個(gè)基因組約30000STS。使每隔100kb就有一個(gè)標(biāo)記。Soejima等[39]通過(guò)顯微切割分離了11q13.4-q25的50個(gè)STS。而建立全基因組的基因圖，將加速對(duì)簡(jiǎn)單孟德?tīng)栃誀罨�因的搜尋和�?duì)復(fù)雜性狀基因的認(rèn)識(shí)，同時(shí)cDNA系列可以申請(qǐng)專利，這就激發(fā)了許多藥物公司對(duì)cDNA測(cè)序的興趣。用顯微切割構(gòu)建cDNA區(qū)帶文庫(kù)，無(wú)論是DNA序列分析還是致病基因的定位侯選克隆都有深遠(yuǎn)意義。

　�。�4）染色體工勻染區(qū)（HSR）的研究
　　HSR是可見(jiàn)的基本擴(kuò)增區(qū)，Xu等[40]發(fā)現(xiàn)在小細(xì)胞肺癌中11q13有基因擴(kuò)增后再發(fā)生重排。關(guān)等[41]則切割了卵巢癌常規(guī)G顯帶中不能確定HSRs的染色體來(lái)源。通過(guò)與正常核型雜交確定了HSRs的染色體來(lái)源。這些選擇性擴(kuò)增區(qū)域包括與卵巢癌相關(guān)的基因。作者共切割7個(gè)病例12個(gè)HSR，其中3例有19q13.1-q13.2擴(kuò)增。已知AKT2是絲氨酸-蘇氨酸激酶基因，定位于19q13.1-q13.2，僅在UACC－326系中有AKT2基因擴(kuò)增，卵巢癌基因侯選區(qū)還發(fā)現(xiàn)有4q16、15q15、15q22、q16q11-p13、2、16q21和16q24。關(guān)等通過(guò)顯微切割與比較基因組雜交克隆了乳腺癌在20q-q13.2位點(diǎn)的三個(gè)相關(guān)基因。

　　（5）克隆易位斷裂點(diǎn)
　　在人類惡性細(xì)胞中通達(dá)染色體易位已確定幾種重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)序列有關(guān)遺傳位點(diǎn)，如細(xì)胞癌基因和抑癌基因。Zhang等[42]確定了在惡性黑色素瘤基因中t(1;6）（q21;q14）的斷裂點(diǎn)，并切割了該裂點(diǎn)區(qū)域，建立DNA微克隆文庫(kù)，分離斷裂點(diǎn)附近Cosmid和YAC，鑒定出一跨斷裂點(diǎn)YAC。Muir等[43]則發(fā)現(xiàn)與頭裂畸形相關(guān)的平衡易位，這兩個(gè)斷裂點(diǎn)都將有助于克隆易感基因。

　　（6）確定多發(fā)斷裂點(diǎn)（斷裂熱點(diǎn)）
　　缺換6q為B淋巴胞瘤中最常見(jiàn)的一種染色體畸變。普通細(xì)胞遺傳學(xué)作圖分析和雜合性丟失（LOH）研究只檢測(cè)了幾個(gè)共同缺失區(qū)，而無(wú)法確定好發(fā)斷裂點(diǎn)。關(guān)等[44]切割了9例病人畸變的6號(hào)染色體。其中5例結(jié)果與G顯帶分析不同，未見(jiàn)末端缺失。4例近著絲粒缺失定位于6q11，1例在6q12，缺失遠(yuǎn)端各異。其余4例有3例斷裂點(diǎn)在6q11,1例在6q12，故可確定斷裂熱點(diǎn)在6q11。關(guān)推測(cè)6q11染色體改變可能是影響一個(gè)與濾泡淋巴瘤相關(guān)基因�；騼H僅是因獨(dú)特結(jié)構(gòu)的一個(gè)胞性位點(diǎn)。

　�、嘶�因定位和基因克隆
　　外生性骨疣（EXT）Ⅰ型、Ⅱ型基因分別定位在8q24.1和11p11,其中EXT1已被克隆。鄧等[45]首次應(yīng)用11p11顯微切割探針池篩選500000個(gè)克隆的骨胳肌cDNA文庫(kù)，得到12個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序發(fā)現(xiàn)一個(gè)克隆與EXT1基因在總長(zhǎng)度500bp的兩個(gè)區(qū)有58%和59%的相似，再以之為探針篩選人腦干和胎盤(pán)cDNA文庫(kù),得到了EXT2基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本,從而克隆了該基因。人心臟河豚魚(yú)毒素耐受性電壓閘門(mén)Na+通道α-體亞單位基因（SCN5A）通過(guò)體細(xì)胞雜交定位于3號(hào)染色體上。Georage等[15]分別切割染色體3pter-q21，3p14-qter,3p22-qter,3pter-p22,3p21，再以SCN5A基因上特異性序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR確定SCN5A位于3p21�；�因作圖對(duì)于正確估價(jià)遺傳病綜合征的侯選基因很有價(jià)值，3號(hào)染色體上還存在有其它電壓依賴離子通道基因（CACNLIA2，定位于3p14.3），編碼確定α-亞單位二氫吡敏感性鈣通道，在腦和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中表達(dá)，這對(duì)于3號(hào)染色體上其它電壓離了通道基因相關(guān)特異性分析很有幫助。Shelley等[16]通過(guò)人鼠雜種細(xì)胞板用PCR確定人β2基因內(nèi)含子的特定序列。為證實(shí)β2基因是否為5號(hào)染色體基因族的一個(gè)，分別切割5q32-q33與5q34-q35，用β2特異性引物擴(kuò)增，5q34-q35出現(xiàn)198bp條帶，從而確定β2基因位于5q34-q35,這是通過(guò)原位雜交無(wú)法做到的。這對(duì)于同源基因定位非常有效。

　　(8)進(jìn)化研究
　　Ambady等[26]切割豬6號(hào)染色體構(gòu)成的探針池，與人的中期分裂相染色體進(jìn)行染色體涂染，發(fā)現(xiàn)其與人1p和1q同源，從而通過(guò)種間比較可確定基因簇、數(shù)量線狀位點(diǎn)（quantitative trait loci,QTL）和進(jìn)行其它物種基因的快速定位與克隆。

　　四、展望
　　染色體顯微切割技術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)相結(jié)合的一種橋梁技術(shù)，結(jié)合其它技術(shù)，已在人類基因組工程與遺傳病等研究與應(yīng)用中取得了不少的成果。由于其獨(dú)特的直接性，可減少污染，拓寬遺傳學(xué)研究范圍，如切割小昆蟲(chóng)體細(xì)胞染色體，這是流式細(xì)胞分類等技術(shù)難以比擬的；構(gòu)建全基因組區(qū)帶特異性cDNA文庫(kù)將對(duì)遺傳病致病基因的定位侯選克隆有所幫助；同源基因的精確定位也有了一種精確有效的方法。在對(duì)整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)、組成和功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究中，染色體顯微鏡切割將發(fā)揮更為重要的作用。

湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 作者：鄧昊 夏家輝審校