細胞培養(yǎng)污染的途徑、危害及預防措施

污染是細胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問題。某些污染的發(fā)生往往難以察覺檢測，而且污染源能長期共存于培養(yǎng)體系中，這類染事實上大部分被人們忽視了。

培養(yǎng)的細胞作為個生物體，會對培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物作相應的反應，造成培養(yǎng)細胞生物學特性的改變，而實驗結(jié)果造成潛在的威脅，而且隨著污染時間的長而增加。
培養(yǎng)環(huán)境中的物理、化學及生物因素都可能入培養(yǎng)環(huán)境造成污染。由于入侵的微生物在培養(yǎng)系中不斷增殖、代謝，因此生物性的污染對細胞的害最大。隨著污染微生物的不斷增殖，交叉污染可能性也不斷增加。此外，微生物代謝消耗大量需的養(yǎng)分，同時產(chǎn)生多種有毒的代謝產(chǎn)物，如酶、抗原及毒素等，進一步對細胞產(chǎn)生毒害作用。因此，識細胞培養(yǎng)污染的途徑及其危害性，建立細胞培規(guī)范的操作方法及規(guī)章制度，可以有效地防止污染保證實驗體系的穩(wěn)定性和可靠性。

1 細胞培養(yǎng)基本技術(shù)　
為了減少污染對細胞培養(yǎng)的影響，必須建立細胞凍存庫。細胞凍存庫應該分主細胞庫(Master cell bank，MC和工作細胞庫(Working cell bank，WC，當需要做實驗時從主細胞庫中復蘇細胞建立工作細胞庫。每一個凍存標本都應明確記錄細胞的性質(zhì)、代數(shù)及有無污染。同時還應建立規(guī)范的檢測程序進行菌檢及細胞鑒定。
為了保證培養(yǎng)細胞系的完整性，必須進行詳細的實驗記錄，應包括以下內(nèi)容:細胞系的種類及來源、有無污染(如細菌，病毒，支原體)、細胞代數(shù)和倍增時間、以及選擇性突變。詳細的記錄有利于對細胞的遺傳及生理特性在常規(guī)傳代培養(yǎng)中因突變、污染及各種原因?qū)е碌母淖冞M行分析。經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞與它較早代數(shù)的凍存細胞相比，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞在適應環(huán)境的過程中，其生物特性已發(fā)生了改變。培養(yǎng)的細胞由若干生長速度及活力各異的亞群組成。隨著培養(yǎng)時間的延長生長速，度快及活力高的細胞亞群逐漸占優(yōu)勢這種選擇性，趨勢會影響整個細胞群的生物特性。應用不同代數(shù)的細胞連續(xù)進行實驗則結(jié)果會發(fā)生偏差。建立細胞凍存庫就能避免這種影響通過復蘇相同代數(shù)的細胞，人們就能在較為均一的條件下重復實驗。
細胞培養(yǎng)工作需要清潔，保持良好的環(huán)境及規(guī)范的操作程序。超凈工作臺是細胞培養(yǎng)中普遍使用的無菌操作裝置，它需要合理的布置及經(jīng)常性的維護。超凈工作臺的工作原理是驅(qū)動經(jīng)高效濾菌凈化后的空氣，通過工作臺面形成氣流屏障，從而阻止外界污染物的侵入并使操作過程中產(chǎn)生的飛沫限制在超凈工作臺中。因為操作過程中可能產(chǎn)生有毒的物質(zhì)，所以采用垂直氣流比水平氣流安全。
當進行移液，傾倒液體的操作過程會產(chǎn)生飛沫并沉積在超凈工作臺內(nèi)物體的表面。超凈工作臺的氣流并不能阻止飛沫的產(chǎn)生，飛沫會隨著氣流的方向飄浮。超凈工作臺不合理的放置、不恰當?shù)木S護以及不規(guī)范的使用會破壞超凈工作臺氣流的方向?qū)е嘛w沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導致超凈工作臺內(nèi)物品污染的主要因素造成潛在污染的進一步傳播。因此為減少交叉污染的發(fā)生，應盡可能減少超凈工作臺內(nèi)的物品。不同細胞系以及同一個實驗室不同操作者所使用的培養(yǎng)試劑一定要分開使用，如胰酶、培養(yǎng)液等。否則，一個操作者的失誤可能引起所有細胞發(fā)生污染。

2　細胞培養(yǎng)的污染　
細胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物。細胞培養(yǎng)污染可分為以下三類：物理性、化學性及生物性。為了使細胞培養(yǎng)的結(jié)果更可靠，應該固定所有培養(yǎng)條件，并保證其重復性。
2.1 　物理性污染的來源、危害及預防　物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學性污染。物理性污染通過影響細胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細胞產(chǎn)生影響。細胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細胞代謝發(fā)生改變，如細胞同步化、細胞生長受抑制甚至細胞死亡。通過實驗室的合理設計及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對細胞的影響。孵箱應放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機械振動的設備，如離心機。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應在室溫中放置一段時間后再進行實驗，以避免過冷的溫度對細胞的影響。
2.2　化學性污染的來源、危害及預防
培養(yǎng)環(huán)境中許多化學物質(zhì)都可以引起細胞的污染�；瘜W物質(zhì)并不總是抑制細胞的生長，某些化學物質(zhì)如激素就可促進細胞的生長。不同細胞對化學物質(zhì)污染的反應是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學性污染的來源。細胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細胞系其最佳培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應嚴格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂 (通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是最常見的化學性污染。
2.2.1　水　水是唯一一種在凝固時膨脹的化合物。因此在選擇凍存細胞的容器時應考慮到這個因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機分子、細胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質(zhì)的超純水。需要注意的是，超純水放置過久其純度會下降。
在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時水經(jīng)常被污染，因為高壓蒸氣鍋及純水機的常規(guī)維護后可能有少量的化學物質(zhì)殘留。為了保證水的純度，我們應采取措施盡量避免化學物質(zhì)的殘留。
2.2.2 　血清　動物血清是細胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學污染的來源。由于血清采集于多個動物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進行一系列實驗時，為了保證實驗的可重復性，最好選用同一批次的血清。
2.2.3　培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑　培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學性污染的來源。細胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應是高純度的，并經(jīng)過權(quán)威機構(gòu)的鑒定，實驗者本人也應對上述成分進行純度鑒定。同時，正確配置和儲存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應該采取標準的操作步驟，避免液體體積計算錯誤，混用類似化合物等錯誤。
2.2.4　培養(yǎng)器皿及容器　細胞培養(yǎng)過程中會使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小，構(gòu)形設計可能會影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的 pH值和細胞生長密度。培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過程中的差異可能對培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲存不同物質(zhì)時應選用合適的塑料或玻璃容器，因為酒精、強酸、強堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。

3　生物性污染的來源、危害及預防　外界的微生物如昆蟲、節(jié)肢動物、原蟲、霉菌、病毒、細菌、無細胞壁的微生物(通常指支原體)和其它類型的細胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染。只要在一個開放的環(huán)境中進行培養(yǎng)，都難以避免發(fā)生污染。發(fā)生污染的可能性取決于操作方法、培養(yǎng)室的無菌環(huán)境以及實驗室的規(guī)章制度。生物性污染對細胞代謝的影響，可因污染源和細胞的種類不同而表現(xiàn)各異。細菌、真菌或其它微生物污染的檢測可以用不同培養(yǎng)基進行檢查。支原體污染的檢測需要特殊的方法。病毒污染的檢測可以使用許多體內(nèi)或體外實驗，包括大鼠或小鼠的接種、逆轉(zhuǎn)錄酶分析、凝血試驗、紅細胞吸附試驗等。
細菌和真菌的污染較易發(fā)現(xiàn)并及時清除，而大多數(shù)實驗室對支原體的污染缺乏足夠的認識。為了防止支原體及其它微生物污染的發(fā)生和傳播，必須建立規(guī)范的無菌操作程序及各種規(guī)章制度。支原體歸屬
于柔膜體綱(Mollicutes)的支原體目，它們都具有以下共性:無細胞壁、無細胞壁主要成分———粘肽的表達。支原體與其它細菌不同之處還在于其胞膜中含有膽固醇或其它甾醇，這種特性使支原體膜更具柔順性，對于物理因素，如壓力、滲透壓、脫水的抵抗力很3大。支原體直徑僅有013～018μm，并且變形能力大，故能通過濾菌器。需要指出的是，只要有一個具有增殖能力的支原體就能引起培養(yǎng)體系的污染。一旦細胞被污染，支原體的滴度隨著時間的延長而逐漸升高，最高可至每毫升10克隆。最為致命的是，即使存在很嚴重的支原體污染，細胞外觀可無明顯變化。如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細胞做實驗，將會嚴重影響實驗結(jié)果。

3.1來源　培養(yǎng)體系中支原體污染的最可能途徑是經(jīng)已被支原體污染的細胞擴散和傳播。細胞被支原體污染后，支原體可以與宿主細胞形成一個共生體系，使污染不斷擴大。一旦發(fā)生支原體污染，支原體和其它微生物會隨著飛沫而不斷傳播。操作過程中移液，傾倒液體時都會產(chǎn)生具有潛在感染能力的飛沫，并沉積在接觸到的表面。這種污染性飛沫能存活數(shù)天甚至數(shù)星期。此外，操作失誤引起的交叉污染也是支原體污染的一個常見途徑。人體的組織及體液成分是細胞培養(yǎng)中支原體污染的主要來源。污染的細胞中通常能分離到人類口腔支原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體以及其它一些與人有關(guān)的支原體，如 M.buccale，M.faucium，M.homo2nis，M.pirum和生殖支原體等。無菌操作過程中，操作者能產(chǎn)生有污染性的隨空氣傳播的飛沫和微粒，造成培養(yǎng)體系的污染。人體外周血、骨髓、淋巴組織原代培養(yǎng)中有可能發(fā)生發(fā)酵支原體的原發(fā)污染(primarycontamination)，這也證明支原體在分化細胞中較未分化細胞更易生長。隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們已能培養(yǎng)來自不同物種如動物、植物、昆蟲的各種細胞，同時也擴大了支原體及其它微生物的宿主范圍。此外，某些支原體，如菜氏無膽甾原體科(Acholeplasmalaidlawii)、M.arginini、 M.hyorhinis、口腔支原體、唾液支原體能寄生不同的宿主，并能在培養(yǎng)體系中穩(wěn)定增殖數(shù)年。牛血清中能分離到A.laidlawii、 M.arginini和M.hyorhinis支原體，因此血清可能成為支原體污染的來源。由于無血清培養(yǎng)基中許多附加成分及試劑是從血清或其它生物制品中制備的，因此無血清培養(yǎng)體系并不能排除支原體污染的危險。盡管隨著培養(yǎng)技術(shù)的進步，血清發(fā)生污染的可能性進一步降低，但只要有一個活的支原體能通過濾菌器，整個培養(yǎng)體系就會被污染。

3.2　危害　支原體通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物及消耗各種養(yǎng)分，如核酸前體及必需氨基酸，從而改變細胞的代謝狀態(tài)。支原體可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原體可以利用尿素作為能源，這會使細胞代謝發(fā)生一系列改變，從而影響蛋白質(zhì)、DAN、RNA合成以及嘌呤從頭合成及補償合成途徑。污染時間的長短及核酸代謝改變決定了支原體污染造成的危害程度，導致細胞染色體斷裂、重排、非整倍體的出現(xiàn)。隨后，細胞的生長特性發(fā)生改變，使某些酶和細胞因子的產(chǎn)生增加，并表現(xiàn)出一些特殊的細胞功能，而其它一些細胞正常的功能則被抑制。某些支原體附著在細胞表面后，會與宿主細胞交換膜
抗原成分。隨著細胞膜成分的改變，細胞的形態(tài)及抗原性發(fā)生改變。細胞污染對研究工作帶來的最大危害是由于錯誤的實驗結(jié)果導致研究誤入歧途。此外，支原體污染還會干擾細胞的篩選，如雜交瘤細胞生長受到抑制并喪失產(chǎn)生單抗的能力。

3.3　預防及控制　污染發(fā)生后首先應確定污染物的種類及污染的程度。為了能正確檢測細菌或支
原體的污染，應先撤去培養(yǎng)液中的抗生素。常規(guī)細胞傳代培養(yǎng)中應用抗生素會導致:①掩蓋了不很嚴重的污染;②導致了耐藥菌的產(chǎn)生。每一種抗生素的抗菌譜都是有限的，而且許多抗生素僅是抑制細菌生長，而非殺菌劑。因為支原體無細胞壁，所以青霉素，頭孢菌素等干擾細胞壁合成的抗生素對于支原體無效。菌檢及支原體檢測只有在撤去抗生素后才能進行。實驗中若發(fā)生污染或其它問題應有詳細的記錄，并由經(jīng)驗豐富的專家分析，找出哪個環(huán)節(jié)出了問題，包括培養(yǎng)液的配置、實驗室環(huán)境的保持和無菌操作過程等，從而不斷完善操作規(guī)程，避免類似問題的現(xiàn)。此外，管理者還應制定細胞培養(yǎng)的各項規(guī)章制度，教育每一個實驗人員遵守。實驗室負責人應根據(jù)情況，制定修改各項規(guī)范的操作程序及人員培訓計劃。一般來說，隨著實驗室規(guī)模的擴大，細胞發(fā)生變異和污染的可能性增加了。因此，大型實驗室應嚴格制定各項操作程序及規(guī)章制度。細胞培養(yǎng)中無菌操作需要清潔的工作環(huán)境、實驗的合理安排、實驗者熟練的操作技巧及強烈的責任感。只有通過不斷地學習、訓練，才能熟練掌握無菌操作技術(shù)。為了盡可能減少污染的發(fā)生，以常規(guī)檢查的方式來監(jiān)督是必要的。細胞培養(yǎng)中發(fā)生污染是不可避免的，我們的目的是盡可能減少污染的發(fā)生及危害。
根據(jù)美國實驗室的調(diào)查報告顯示，至少10%的細胞系存在支原體的污染。一旦發(fā)生污染，如果細胞有詳細的記錄，則污染引起的危害較小。我們可以根據(jù)細胞定期菌檢記錄拼棄最后一次細胞菌檢陰，性后的實驗結(jié)果。利用菌檢陰性的細胞重新開始實驗。如果僅偶爾進行菌檢或采用非特異檢測方法，尤其是支原體污染，那么確定污染的范圍比較困難。因為所有的細胞系都有可能被交叉污染。一旦發(fā)生污染，所有未進行菌檢的凍存細胞都必須進行菌檢，以去除污染的細胞并明確污染發(fā)生的時間。

3.4　檢測　由于支原體污染并不引起細胞外觀的明顯變化，故常規(guī)的支原體檢測非常必要的。人們可利用一系列直接或間接的方法檢測支原體。但由于支原體種類的多樣性，目前還沒有一種方便、廣譜、特異性高、準確的檢測方法。因此，有必要對不同檢測方法的靈敏度及局限性有所了解。

不同檢測方法對送檢標本的要求不同，如果標本不合格，將不可能獲得正確的結(jié)果。血清、培養(yǎng)液或培養(yǎng)基附加成分在加工和儲存過程中污染會在一6定程度上被稀釋，影響檢出率。間接檢測法由于其敏感性較差，若不采用濃縮標本，則不適用于檢測血清和培養(yǎng)液的污染。由于污染物的隨機分布，因此僅進行一次檢測通常會出現(xiàn)假陰性。如果標本中污染物濃度低于10個污染物/ml，隨機抽取1ml標本進行檢測可能有366%的假陰性率。增加1標本體積，濃縮標本有助于降低假陰性率。另一種假陰性的產(chǎn)生是由于污染物在試劑瓶，凍存瓶等容器中的分布不均所致。若20個樣品中有一個被污染(5%的污染率)，檢測所有20個樣品，假陰率為。需要指出的是僅僅單次檢測一個標本來3616%，判斷有無生物性污染的作法是不可靠的。因此，在分裝液體前，就應當從原液中盡可能多取一點液體進行檢測。如果不能做到這一點，則應該用標準方法選擇多個標本進行檢測。例如，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應選擇最后過濾的液體進行檢測。
標本的處理與標本的選擇同樣重要。各種酶如胰酶、脂酶，強酸，強堿或其它化學物質(zhì)會破壞支原體膜的脂質(zhì)，使支原體喪失活力及膜的完整性。膜的完整性被破壞后，支原體內(nèi)的蛋白酶及核酶釋放，從而會干擾間接檢測方法的結(jié)果。如果標本收集后不能當天檢測，則應該盡快凍存標本以防止降解。

選擇、處理檢測標本的目的是盡可能發(fā)現(xiàn)潛在的污染。在細胞培養(yǎng)過程中就應考慮到支原體污染的檢測。我們最好選用無抗生素培養(yǎng)，檢測應盡可能離傳代時間長一點，以便讓任何潛在的污染物生長、繁殖。為防止支原體活力喪失，如果檢測的是貼壁細胞，應采用刮除細胞的方法，因為胰酶或其它生化分離方法會降低支原體的活性。在選用合適的檢測方法時，應考慮到支原體的滴度和活力這兩個因素。直接培養(yǎng)法是最敏感的，但也是最耗時的檢測方法，大約需28天。從理論上講，只需一個有活力的支原體就能在培養(yǎng)基上生長。但某些難以培養(yǎng)的支原體限制了直接培養(yǎng)法的應用。理想的直接培養(yǎng)法應采用多功能的培養(yǎng)基，以降低假陰7性率。為增加對低滴度和低活力支原體檢出率，應采用有氧和無氧兩種培養(yǎng)條件及幾種傳代方式。直接培養(yǎng)法還需要活性支原體作為陽性對照，而且耗時，操作繁瑣，因而不適于大多數(shù)實驗室。檢測支原體污染的間接法包括CR、 ELISA、電子顯微鏡檢查、DNA探針、DNA熒光染色及生化7分析法等。間接法能檢測到10/L的滴度。通常情況下，支原體污染后其滴度一般超過 10/L，故盡管間接法不敏感，但相對較精確。由于支原體的多樣，表達不同特異性的抗原及酶，為生化及免疫檢測8法帶來技術(shù)上的困難。在選擇PCR、 DNA探針等方法前，應考慮好選擇合適的靶序列及引物序列。DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法相結(jié)合是支原5體檢測的金標準。美國、加拿大、日本和歐共體國家生物制藥及診斷的監(jiān)督機構(gòu)推薦使用這種方法。其基本原理在于利用不同的技術(shù)，多次檢測，以彌補各種檢測技術(shù)的缺陷，增加檢測結(jié)果的可信度。

3.5 　控制及排除　控制支原體污染或其它生物性污染的唯一可靠的方法是所有可能污染的物品用高壓蒸氣滅菌法消毒。所有細胞培養(yǎng)設備都應消毒，應嚴格遵守上述的各項規(guī)章制度及監(jiān)督制度，直至所有潛在的污染源都被消除。細胞一旦被支原體污染，要將它清除是非常困難的。由于一些不可復得的細胞被污染，人們不得不設法清除污染，挽救一些珍貴的細胞。事實上，經(jīng)支原體污染的細胞，在污染經(jīng)處理被清除后，細胞原有的許多生物學特性，如基因的表達，抗原性和代謝特點也隨之發(fā)生了相應的改變。排除支原體污染的方法，包括使用抗生素、抗血清、裸鼠體內(nèi)接種、巨噬細胞吞噬、胰酶消化等方法，但沒有一種方法是普遍有效的。所以在采用每一種方法時必須對其效果以及對細胞可能產(chǎn)生的毒性影響進行監(jiān)測。Del6Guidice和Gardella提出了一個有效的方法，其基本步驟包括首先分離、鑒定污染物及測定對抗生素的敏感性，然后使用至少兩種敏感的抗生素進行處理。為增加排除污染的有效性，可以通過稀釋以降低血清及其它促生長因子的濃度，從而降低細胞的密度。治療后細胞應在無抗生素條件下培養(yǎng)若干代，以確定污染已被徹底清除。細胞培養(yǎng)過程中支原體污染不易察覺，細胞被支原體污染后清除非常困難，支原體污染的細胞在支原體被清除后，其細胞特性會發(fā)生很大改變，對研究結(jié)果造成嚴重影響因此，為了保證細胞培養(yǎng)體系免受污染的影響，關(guān)鍵是加強預防措施。