Western Blot (免疫印記法)常識(shí)問答

1. 什么是western blot?
答：WB又稱免疫印記法.是將生物大分子物質(zhì)通過不同途徑轉(zhuǎn)移到固相載體的過程。

2. western blot 有什么優(yōu)點(diǎn)？
答：靈敏，可達(dá)ng級(jí)，用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級(jí)。方便，特異性高。

3. western blot 的具體步驟是什么？
答：一. 制樣（以提動(dòng)物組織總蛋白為例），
1） 組織洗滌后加入3 倍體積PBS，0℃研磨。
2） 加入5×STOP buffer
3） 180W, 6mins，0℃超聲波破碎
4） 5000rpm，5mins 離心，取上清。
5） 加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）
6） 煮沸，10min
7） 分裝，于-20℃保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。

二． 電泳（SDS-PAGE）
建議欲檢測抗原10－30kd, 用15％膠；30－100kd, 用10％膠；100－200kd，用7.5
％膠。
1）配膠（one piece）A.分離膠。單位：ml。Total: 8ml
7.5％ 10％ 15%
2×Sep. buffer 4 4 4
30％ Gel.sol 2.0 2.7 4
ddH2O 1.9 1.2 0
TEMED 8ul 8ul 8ul
10%APS 80ul 80ul 80ul
B. 濃縮膠。單位：ml。Total: 3.5ml
3％
2×Stacking. buffer 1.7
30％ Gel.sol 0.35
ddH2O 1.4
TEMED 5ul
10%APS 50ul

2)點(diǎn)樣。上樣蛋白量不應(yīng)超過30ug/mm2. (載荷面即：如果你的膠槽是5mm×1mm, 則
載荷面為：1mm×5mm=5mm2)

3）電泳。開始用80V電壓，但是當(dāng)溴酚藍(lán)至分離膠時(shí)，用100-120V電壓。

4）轉(zhuǎn)移（一塊膠）。
A.半干法。
a. 取六張濾紙（Bio-Rad，1mm），三張做上層濾紙，三張做下層。其中，
上層濾紙一定要比較干凈，無污染。用前都用Transfer buffer 浸泡至少
五分鐘。
b. 準(zhǔn)備硝酸纖維素薄膜，用時(shí)先用甲醇浸泡1-3min.倒掉后，再用Transfer
buffer 浸泡。
c. 做三明治。陽極上鋪三張下層濾紙，再浸泡過的膜，再鋪膠，然后鋪三
實(shí)驗(yàn)方法互助區(qū)——蛋白區(qū)
張上層濾紙，最后鋪上三張上層濾紙，蓋上陰極。注意每層之間不能有
氣泡。膜上用鉛筆畫出膠的邊緣。標(biāo)上下。
d. 轉(zhuǎn)移，0.8mA/cm2-3mA/cm2. 經(jīng)驗(yàn)是：100kd-200kd，用2mA/cm2，2hrs;
30-100kd用1.0-2.0mA/cm2，40mins-1.5h；10kd-30kd％用0.5-0.8mA/cm2，
15mins-40mins.
B.濕法。
a. 取四張濾紙，兩張做上層濾紙，兩張做下層。其中，上層濾紙一定要比較
干凈，無污染。
b. 準(zhǔn)備硝酸纖維素薄膜，用時(shí)先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉后, 再用Transfer
buffer 浸泡。
c. 做三明治。
e. 轉(zhuǎn)移�？乖�≥100kd, 先28V轉(zhuǎn)移1h, 然后84V轉(zhuǎn)移14-16h, ≤100kd， 則
63V轉(zhuǎn)移4-16h.

三 封閉：5％牛奶4℃封閉過夜，或RT 1hr.

四 第一步反應(yīng)：5％牛奶或2％BSA稀釋抗體（稱一抗），稀釋比例按抗體說明,室溫
孵育1hr，

五 洗滌：TBST 洗5 mins 3-5 次。

六 第二步反應(yīng)：將膜跟5％牛奶或2％BSA稀釋的2 抗一起孵育，室溫1hr。

七 洗滌：TBST 洗5 mins 3-5 次。
八 顯色：

4. western blot 所需buffer 的配方是什么？
答：主要的buffer有：
1） 2×Separation buffer (PH: 8.8)
0.75M TRIS.HCl 90.825g
0.2% SDS 10ml 20% SDS
Total: 1000ml
2) 30% gel Solution
0.8% kis-aciylamide 0.8g
29.2% aciylamide 29.2g
Total: 100ml
3）10％ APS: 0.1g 溶于1.0ml ddH2O.
4) 2×Stacking buffer(PH: 6.8)
0.2M Tris 15.14g
0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS
Total: 500ml
5) 10×Running buffer(PH: 8.3)
250mM Tris 60.55g
1.9M Glycine 285.27g
1% SDS 20g or 100ml 20% SDS
Total: 2 liters
6) Semi-dry transfer buffer(PH:8.3):
48mM Tris 5.8g
39mM Glycine 2.9g
0.037% SDS 0.37g
實(shí)驗(yàn)方法互助區(qū)——蛋白區(qū)
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
7) Wet transfer buffer 1(PH: 8.3): （20－400kd）
50mM Tris 5.8g
380mM Glycine 29g
0.1% SDS 1.0g
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
8) Wet transfer buffer 2(PH: 8.3) ＜80kd
25mM Tris 5.8g
190mM Glycine 29g
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
9) blocking buffer:
5% milk 5g
TBST 100ml
※：奶粉為脫脂奶粉。
10) 10×TBS (PH: 7.6)
NaCl 80g
Tris 30g
Total: 1000ml
11) TBST (PH: 7.4)
NaCl 25mM
Tris 100Mm
Tween-20 0.2%
Total: 1000ml
12) 5×STOP buffer (PH: 6.7)
20% Glycerol 100ml
10% SDS 50g
250mM Tris 15.14g
用時(shí)取9.0ml，加入0.5ml β-ME和0.5ml 溴酚藍(lán)，可制成sample buffer。

5. western blot 常見問題有那些？
1) 為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？
答：原因有很多，1 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；2 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMST，抑制蛋白酶活性；3 你的抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。
2）我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答：1 有沉淀可能是因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長，2 也不排除你的抗原濃度過高，這時(shí)再加入適量sample buffer即可。
3）我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），請(qǐng)問怎么做WB？
答：可以選擇PSQ 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其
他按步驟即可。
4）我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？
答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。
實(shí)驗(yàn)方法互助區(qū)——蛋白區(qū)
5）膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛�，改變一抗孵育時(shí)間，牛奶濃度提高。
6）目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長，將周圍底物催化完，形成了空白。將一抗和二抗?jié)舛冉档�，或更換新底物。
7）我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
1 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；2 ECL底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；3 ECL
底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；4 二抗失活。
8）問我顯影液顯影1分鐘,和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：1可能是紅燈造成的,可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.
膠片本來就被曝光了2顯影時(shí)間過長.
9）DAB好還是ECL好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；
ECL結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。
10）抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？
答：抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長，可以打開二聚體。在上層膠中加入尿素至8M也可以打開。
11）半干轉(zhuǎn)是否要求膜，濾紙，膠同樣大�。�
因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn)，那樣會(huì)不會(huì)短路？
什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？
答：一般參照膜>= 濾紙> 膠, 就行，
你轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。
12）電泳時(shí)Marker 按說明加5ul，但電泳中看不見，是失活了嗎？
答：加入20ul即可。
13）蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么了？
答：可能是1樣品濃度過低2轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠，。
14) 我的一抗量較少，同時(shí)我也不知道一抗的最佳稀釋比例是多少，怎么做呢？
答：確定實(shí)驗(yàn)過程無污染后，將含抗體的稀釋液回收，保存于-70℃。最好第一次的濃度做高一點(diǎn)，這樣，如果結(jié)果不好，可以嘗試再稀釋。