淺談全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)及其在生物學(xué)中的應(yīng)用

摘要：全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù),它利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的隱失場來照明樣品,從而致使在百納米級厚的光學(xué)薄層內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā),熒光成像的信噪比大大提高。近年來，全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)已被生物物理學(xué)家們廣泛應(yīng)用于單分子的熒光成像中。本文簡要介紹了全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)的基本知識及其在生物學(xué)方面的一些應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)隱失波 生物單分子

引言：世界上第一臺(tái)光學(xué)顯微鏡的產(chǎn)生，使人們能夠觀察到肉眼不能觀察到的東西。經(jīng)過幾百年的發(fā)展，經(jīng)過物理學(xué)家的不斷努力，顯微鏡的性能不斷提高，成像質(zhì)量大為改進(jìn)。許多新的光學(xué)顯微鏡也應(yīng)運(yùn)而生，如偏振光顯微鏡、相差顯微鏡、倒置顯微鏡等。但是，在細(xì)胞生物學(xué)方面?zhèn)鹘y(tǒng)光學(xué)顯微鏡始終不能解決生物樣本顯微中的幾個(gè)重要問題：1.顯微圖像的信噪比不高2.光源對生物樣本照射的損傷3.光學(xué)衍射所致的分辨極限（R ≥0. 61λ/nsinθ）。而這三個(gè)問題恰恰是生物單分子探測中亟待解決的問題。

20 世紀(jì)30 年代電子顯微鏡的發(fā)展導(dǎo)致了細(xì)胞研究的革命,使得生物學(xué)家得以從亞顯微水平上認(rèn)識細(xì)胞世界。進(jìn)入80 年代,非光學(xué)類掃描探針顯微術(shù)特別是原子力顯微鏡的出現(xiàn)更是將成像的分辨率推進(jìn)到納米的精度。與此同時(shí),新一代光學(xué)顯微技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，它們以其高的空間分辨率和時(shí)間分辨率、無損傷、以及對單分子活體探測的可行性,再次成為生物學(xué)家、物理學(xué)家和成像學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。目前國際上公認(rèn)的最有前途的單分子光學(xué)成像技術(shù)有全場相襯顯微術(shù)、共焦熒光顯微術(shù),近場光學(xué)掃描顯微術(shù)和全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)[1]。這些技術(shù)在分子生物學(xué)、分子化學(xué)、激光醫(yī)學(xué)及納米材料等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注,并產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。

全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù),它利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的隱失場來照明樣品,從而致使在百納米級厚的光學(xué)薄層內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā),熒光成像的信噪比大大提高。Hirsch field于1965年完成了第一個(gè)全內(nèi)反射熒光實(shí)驗(yàn),這是首次嘗試用全內(nèi)反射熒光法測液體中的單個(gè)分子的熒光。將全反射理論與生物細(xì)胞的熒光成像技術(shù)相結(jié)合的TIR-FM技術(shù)是一種全新的突破.雖然它的具體應(yīng)用還不到10年的時(shí)間,但是它在單分子探測中已顯示出強(qiáng)大的生命力.1995年,Yanagida小組用TIRFM技術(shù)首次在液體溶液中得到了熒光標(biāo)記的單個(gè)蛋白質(zhì)分子的成像.1996年,Moerner小組又用這項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了限制在丙烯酰胺膠體的納米孔中的單分子的三維成像.

至今,全內(nèi)反射熒光法在理論上和應(yīng)用上均已得到較大發(fā)展,出現(xiàn)了多種全內(nèi)反射熒光法,如時(shí)間分辨全內(nèi)反射熒光、多重內(nèi)反射熒光和全內(nèi)反射熒光相關(guān)光譜等方法。全內(nèi)反射熒光配合偏振技術(shù)和時(shí)間分辨技術(shù)在研究表面分子或近表面分子的取向、旋轉(zhuǎn)和熒光壽命方面已取得很好的效果。

全內(nèi)反射的基本理論[2][3]
全內(nèi)反射 全內(nèi)反射現(xiàn)象是生活中的一種常見現(xiàn)象，如鉆石的色彩斑斕和光纖的光線傳播等。如圖1所示 ，當(dāng)一束平面光波從折射率為n1的介質(zhì)進(jìn)入到折射率為n2的介質(zhì)中。入射光在兩介質(zhì)接觸面一部分發(fā)生反射，一部分發(fā)生折射。入射角θ1和透射角θ2之間滿足關(guān)系式
n1sin θ1=n2 sin θ2 （1）
若n1大于n2，由公式（1）可以看出當(dāng)入射角增大時(shí)，透射角也增大。假設(shè)增大到臨界角θc時(shí)的透射角為90°。當(dāng)光線以大于或者等于臨界角θc入射時(shí)，入射光在界面處只發(fā)生反射而不再透射進(jìn)n2介質(zhì)，也就是發(fā)生了全反射。由snell定律可知
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) （2）
由上式可知，當(dāng)n1大于n2時(shí)，全反射就可能發(fā)生。如果玻璃的折射率取為1.52，溶液的折射率取為1.33(生物細(xì)胞的折射率范圍是1.33～1.38)，則玻璃/界面處的臨界角為61.74°。即當(dāng)光線從玻璃中射入溶液中時(shí)，入射角大于61.74°時(shí)就會(huì)發(fā)生全反射。
隱失波 從幾何光學(xué)的角度來看,當(dāng)發(fā)生全反射時(shí),光會(huì)在玻璃界面上完全反射而不進(jìn)入液體溶液中。實(shí)際上,由于波動(dòng)效應(yīng),有一部分光的能量會(huì)穿過界面滲透到溶液中,平行于界面?zhèn)鞑ァ＿@部分光就是所謂的隱失波。隱失波是一種非均勻波，它沿著入射面上的介質(zhì)邊界傳播，在平行界面方向以平行波場方式傳播而在垂直界面方向則是呈指數(shù)衰減。透射強(qiáng)度和浸透深度公式如公式（3）所示。由公式知，對于可見光波長而言，浸透深度為～100nm。

全內(nèi)反射熒光顯微鏡
到目前，科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)展了多種全內(nèi)反射熒光顯微成像系統(tǒng)。其中最為普遍的兩種類型是棱鏡型和物鏡型。（如圖2所示）棱鏡型成像系統(tǒng)的隱失場是通過入射光經(jīng)棱鏡發(fā)生全反射產(chǎn)生的，而物鏡型的是通過入射光經(jīng)物鏡本身全反射產(chǎn)生。隱失波激發(fā)生物樣品的熒光分子，熒光分子所發(fā)射的熒光經(jīng)過物鏡成像到照相機(jī)或CCD上實(shí)現(xiàn)對生物樣品的記錄。（如圖3所示）
兩種形式的顯微鏡各有優(yōu)缺點(diǎn)，對于棱鏡型而言，實(shí)現(xiàn)起來相對簡單，同時(shí)它的缺點(diǎn)也很明顯：由于要達(dá)到較高的光學(xué)分辨率，要求接收熒光的物鏡工作距離較短，這樣留給生物樣品和物鏡之間的空間較小，所以在此儀器上安裝一些諸如原子力顯微鏡、近場光學(xué)顯微鏡等其他探測儀器非常困難。并且由于熒光的接收必須經(jīng)過圖2（a）所示的被觀察樣品的上部，這樣熒光必然會(huì)有散射、衰減及其它光信號的干擾，使觀察的效果有所下降。而對物鏡式而言，則可以克服以上缺點(diǎn)。物鏡式顯微鏡的物鏡既作為收集樣品熒光信號的接受器，同時(shí)又作為發(fā)生全反射的光學(xué)器件。如圖2（b）所示，激光聚焦到物鏡后焦面并經(jīng)過物鏡邊緣入射，物鏡出射光為平行光并斜入射至蓋玻片上，調(diào)節(jié)激光入射位置和角度，即可達(dá)到全內(nèi)反射要求，從而實(shí)現(xiàn)隱失波照明。隱失波所激發(fā)的熒光仍舊經(jīng)過物鏡接收，通過雙色鏡濾掉除熒光以外的其它波長的光，成像在物鏡后方的照相機(jī)或CCD上，實(shí)現(xiàn)對生物樣品的熒光記錄。由于樣品上方空間完全空出，并且所接受的熒光沒有被樣品干擾，所以目前大多數(shù)生物學(xué)家采用物鏡式全內(nèi)反射熒光顯微鏡。

在生物學(xué)上的應(yīng)用
細(xì)胞內(nèi)的很多至關(guān)重要的生命活動(dòng)過程均存在于細(xì)胞表面,如果我們可以直接對這些細(xì)胞表面的過程進(jìn)行觀測,而不受到來自細(xì)胞內(nèi)深層區(qū)域信號的干擾,這對細(xì)胞生物學(xué)研究來說,將是具有重大意義的突破[5～7]。全內(nèi)反射熒光顯微鏡的最大優(yōu)勢就是利用隱失波照明,它的熒光激發(fā)深度只在～100ｎｍ的薄層范圍內(nèi),從而成為研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動(dòng)力學(xué)、單分子動(dòng)力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù)。
全內(nèi)反射熒光法在生物中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾方面:蛋白質(zhì)吸附平衡、表面分子濃度梯度變化、表面分子的旋轉(zhuǎn)、熒光壽命及反應(yīng)速率的測量及選擇性觀測細(xì)胞/底物接觸區(qū)等。其中蛋白質(zhì)界面吸附平衡是全內(nèi)反射熒光法的重點(diǎn)應(yīng)用領(lǐng)域[8]�？赏ㄟ^研究蛋白質(zhì)在人工表面的吸附平衡來了解各種生物材料的表面性質(zhì)。Edmisten等[9]利用全內(nèi)反射熒光各向異性和吸收二色性結(jié)合研究細(xì)胞膜中的分子旋轉(zhuǎn)分布。Chan等[10]將全內(nèi)反射熒光用于液-固界面的ＤＮＡ寡核苷酸的吸附和表面擴(kuò)散研究。利用一種ｐＨ敏感熒光團(tuán)產(chǎn)生的全內(nèi)反射熒光,可觀測吸附水解酶的自發(fā)重構(gòu)化[11]。全內(nèi)反射熒光技術(shù)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測核酸相互作用[12]、考察吸附在石英上的水解酶分子的重定向機(jī)制[13],以及觀察細(xì)胞膜100ｎｍ范圍內(nèi)的實(shí)時(shí)生命活動(dòng)[14]也都有報(bào)道。

展望
全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)作為細(xì)胞表面單分子成像的一種新興的技術(shù)，Derek Toomre[2]等認(rèn)為它將向兩個(gè)前沿方向發(fā)展，一方面是將繼續(xù)與其它顯微成像技術(shù)如熒光相關(guān)光譜技術(shù)(FCS),熒光壽命成像技術(shù)(FLIM)以及原子力顯微術(shù)(AFM)相結(jié)合;另一方面是發(fā)展雙色和多色TIR-FM，采用多種染色來觀察活體細(xì)胞。這兩個(gè)方面在近些年都有了很大發(fā)展，如Takafumi Yamada[15]等用AFM和TIR-FM結(jié)合觀察到高靈敏度的蛋白分子，Shhei Nishida[16]等對單細(xì)胞進(jìn)行納米操作等。單波長光激發(fā)的雙色熒光觀察活細(xì)胞也有報(bào)道。[17，18]隨著光電探測設(shè)備探測效率和探測速度的提高以及單分子染色技術(shù)的發(fā)展，我們有理由相信，全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)將會(huì)更加清晰的將活體細(xì)胞膜表面的動(dòng)態(tài)成像展現(xiàn)在我們面前。

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