腸道病毒EV71 TaqMan熒光定量RT PCR法快速檢測
據(jù)中央電視臺報道，2008年4月29日上午8：30，安徽省衛(wèi)生部門發(fā)布了當(dāng)?shù)貎和腥灸c道病毒EV71的最新情況。據(jù)悉，截至28日，累計(jì)報告了腸道病毒EV71感染病例1520例，死亡沒有增加，仍是20例。
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【摘要】 目的 建立一種特異、靈敏、快速的熒光定量RT-PCR方法檢測腸道病毒核酸，應(yīng)用于暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測。方法 根據(jù)GenBank登錄的腸道病毒基因序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對，在腸道病毒基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針；對熒光RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證方法的特異性和靈敏度。同時對疑似腸道病毒感染者的臨床樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果 該方法對腸道病毒的檢測有高度的特異性，可檢出脊髓灰質(zhì)炎、柯薩奇和埃可等腸道病毒，與腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、乙型腦炎等病毒均無交叉反應(yīng)。檢測的靈敏度達(dá)0．1病毒效價滴定(TCID50)；可直接從疑似腸道病毒感染者的腦脊液、皰疹液和糞便等標(biāo)本中檢測腸道病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右。結(jié)論 所建立的TaqMan熒光定量RTPCR是一種快速檢測腸道病毒特異、敏感的方法，適用于由腸道病毒感染引起的應(yīng)急疫情的實(shí)驗(yàn)室早期診斷。
【關(guān)鍵詞】 熒光定量RTPCR；TaqMan探針；腸道病毒；臨床標(biāo)本
腸道病毒(EV)屬于小RNA病毒科，根據(jù)血清學(xué)可以分為脊灰病毒、柯薩奇、�？刹《竞湍c道病毒68～71型，共67個血清型。腸道病毒可引發(fā)眾多疾病，并可暴發(fā)流行，導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重危害人類健康。浙江省近幾年由腸道病毒引起的無菌性腦炎〔1，2〕、手足口病〔3〕、急性出血性結(jié)膜炎和新生兒急性心肌炎等暴發(fā)疫情頻頻發(fā)生。為了迅速查明病因，及時采取控制措施，亟需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速診斷，但腸道病毒傳統(tǒng)的檢測方法是病毒分離和中和法定型，不僅繁瑣費(fèi)時，而且無法對所有的血清型進(jìn)行鑒定，更不能對一些抗原變異株或新型別毒株進(jìn)行鑒定。本研究建立的腸道病毒熒光定量RTPCR方法，為腸道病毒實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測提供了有效的分子生物學(xué)檢測手段。
1.材料與方法:
1.1 病毒標(biāo)準(zhǔn)株與臨床標(biāo)本 脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin Ⅰ～Ⅲ型疫苗株(北京生物制品研究所)；柯薩奇、�？珊湍c道病毒70～71型等標(biāo)準(zhǔn)株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、乙型腦炎等毒株(中國疾病預(yù)防控制中心)。臨床樣本來源于浙江省近幾年各地報告的疑似腸道病毒感染疫情如無菌性腦炎、手足口病、疑似脊髓灰質(zhì)炎和急性出血性結(jié)膜炎等患者的腦脊液、皰疹液、糞便和眼拭子等，樣本采集后常規(guī)送至實(shí)驗(yàn)室。
1.2 引物與探針 從GenBank上下載不同年份和地區(qū)的腸道病毒基因序列，用生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性比較，在5′非編碼保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，序列為EVF：5′CTGYRGCGGAACCGACTAC3′；EVR：5′ATTGTCACCATAAGCAGCCA3′；EVProbe：5′FAMTTGGGTGTCCGTGTTTMGB3′。引物和探針委托上�；瞪锕こ逃邢薰竞铣�。
1.3 病毒定量標(biāo)準(zhǔn)與病毒RNA的提取 以Sabin Ⅲ型疫苗株為標(biāo)準(zhǔn)毒株，用人橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)進(jìn)行病毒效價滴定(107，5TCID50／ml)后作為參考株，將其稀釋TCID50分別為1000，100，10，1，01，001于每個反應(yīng)管。病毒RNA的提取按試劑盒說明書(德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit)。
1.4 熒光RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化 試驗(yàn)在以相同濃度陽性核酸為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從100～900μmol／μl，探針濃度從50～300μmol／μl,采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測，根據(jù)熒光RT-PCR反應(yīng)的最低熒光閾值(Ct值)和最高熒光強(qiáng)度增加值(△Rn)選擇最佳引物和探針濃度。試劑盒采用(AKARA公司)熒光RT-PCR Kit，按試劑盒說明書操作。
1.5 RTPCR反應(yīng) 腸道病毒RT-PCR通用引物參照文獻(xiàn)〔4〕，EV1：5′AAGCACTTCTGTTTCCC3′(166-182)，EV2：5′ATTCAGGGGCCGGAGGA3′(447463)，擴(kuò)增片斷297bp。采用RTPCR試劑盒(美國Roche公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μl。其中5×RTPCR緩沖液4μl，4種脫氧核苷酸(dNTP)混合物(10mmol／L)16μl二硫疏糖醇(DTT)(100mmol/L)10μl,RNase抑制劑(5u/μl)04μl，20μmol／L上游引物與下游引物各0.5 μl，Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合物(5u／μl)04μl，模板RNA 10μl，最后用焦碳酸二乙脂(DEPC)水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為50℃ 30min，94℃ 2min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和變性，然后94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 1min進(jìn)行擴(kuò)增，35個循環(huán)后轉(zhuǎn)入68℃ 7min，取8μl產(chǎn)物電泳后判斷有無特異性條帶。
1.6 熒光RTPCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 選擇腸道病毒：脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ～Ⅲ型，柯薩奇病毒A16,A24，B1，B3，B5,埃可病毒7，20，30型和腸道病毒71型，以及選擇容易引起腦炎等癥狀的非腸道病毒，麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、乙腦、登革熱病毒等，對上述2組病毒分別提取核酸，用腸道病毒熒光RTPCR方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證方法的特異性。對已標(biāo)定TCID50的腸道病毒Sab in Ⅲ型(107，5TCID50／ml)稀釋后分別提取RNA，平行進(jìn)行熒光RTPCR與RTPCR反應(yīng)，比較其靈敏度。此外，對每一個濃度的病毒稀釋液作5次重復(fù)檢測，得到的Ct值采用stata80軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。
1.7 統(tǒng)計(jì)分析 熒光RTPCR法的Ct值采用Stata80軟件計(jì)算其±s
2 結(jié)果
2.1 熒光RTPCR反應(yīng)體系及條件 采用一步法熒光RTPCR試劑盒，總反應(yīng)體系為25μl。矩陣法優(yōu)選后引物最佳濃度均為064μmol/L，探針最佳濃度為0.30μmol／L，模板RNA 10μ1，最后用DEPC水補(bǔ)至25μl。用MJ Research Option 2熒光檢測系統(tǒng)或Roche Lightcycle熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，反應(yīng)參數(shù)為：45℃ 30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2?min，以93℃ 15s，60℃ 1min擴(kuò)增40個循環(huán)，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測，可獲得最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度。
2.2 特異性試驗(yàn) 本研究建立的熒光RTPCR方法對腸道病毒具有較好的特異性，可檢測PVl-3，Cox A16、A24、Bl、B3、B5，ECH07、20、30，EV70～71型等不同群的腸道病毒，而與腮腺炎、乙腦、登革熱、麻疹、風(fēng)疹病毒等均無交叉反應(yīng)。
2.3 敏感性試驗(yàn) 對腸道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株，采用RD細(xì)胞進(jìn)行病毒效價測定(107，5TCID50/ml)，然后稀釋成1000，100，10，1，0.1，0.01 TCID50，提取病毒RNA，分別用熒光RT-PCR與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果熒光RT-PCR方法檢測敏感性達(dá)到0.1 TCID50，比常規(guī)RT-PCR方法的靈敏度1.0 TCID50高10倍左右。
A～E：1000，100，10，1，0.1 TCID50
圖1 熒光PT-PCR法檢測腸道病毒的靈敏度（略）
2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 腸道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株按10倍梯度稀釋成4個不同的濃度，對每一個濃度的樣本作5個重復(fù)檢測，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.23～0.65之間，具有較好的重復(fù)性。
表1 熒光RT-PCR法檢測腸道病毒核酸的重復(fù)性試驗(yàn)（略）
2.5 樣本的檢測 從浙江省各地報告的病毒性腦炎、手足口病、急性出血性結(jié)膜炎和急性心肌炎等等疑似腸道病毒感染疫情患者的腦脊液23份、糞便20份、皰疹液8份和眼拭子7份等臨床樣本中直接提取病毒RNA，用建立的熒光RT-PCR方法檢測腸道病毒核酸。結(jié)果顯示，58份樣本中腸道病毒核酸陽性的有32份。同時對上述樣本采用RD和Hep-2細(xì)胞進(jìn)行腸道病毒分離，結(jié)果病毒分離陽性的24份，其余8份熒光RTPCR方法陽性而病毒分離陰性的樣本，采用腸道病毒通用引物直接從樣本中提取病毒核酸后進(jìn)行1次或2次RTPCR擴(kuò)增相應(yīng)片段、測序和BLAST比對，最終確定為腸道病毒。
3 討論
腸道病毒是最常見感染人類的病毒，可導(dǎo)致多種疾病，臨床表現(xiàn)多樣，近幾年由腸道病毒引起的暴發(fā)疫情時有發(fā)生〔1-3,5〕。對該類疫情盡早作出實(shí)驗(yàn)室確診是及時采取防控措施與對癥治療的關(guān)鍵。近幾年發(fā)展起來的以特異性熒光探針為特點(diǎn)的熒光定量PCR技術(shù)，實(shí)行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會，而且較常規(guī)RTPCR技術(shù)，無診從敏感性、特異性與速度上都更具有優(yōu)勢，當(dāng)然它對引物和探針的設(shè)計(jì)也提出了更高的要求〔6-8〕。我們從美國的NCBI與日本的DDBJ基因庫上下載了近20年來世界各地的腸道病毒株，對其進(jìn)行了同源性比較，在腸道病毒5′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)若干對引物與Taqman探針，對該區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從中篩選出最佳的引物和探針，并對熒光RT-PC方法進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證其敏感性、特異性和重復(fù)性。經(jīng)腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)株與臨床樣本的檢測比較，該方法具有高特異性，能檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ～Ⅲ型、柯薩奇病毒Bl、B3、B5，�？刹《�7、20、30型及新型腸道病毒70～71型等多個血清型別的腸道病毒，與腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、乙腦、登革熱病毒均無交叉反應(yīng)，而且比常規(guī)RTPCR和病毒分離法更敏感、快速和簡便。通常腸道病毒的RTPCR檢測敏感度在1.0 TCID50左右，從病毒核酸提取、RTPCR反應(yīng)與電泳，整個過程大約需6～7h左右，而采用本方法從核酸提取至完成檢測，僅需3h左右，能同時完成多個疑似患者臨床樣本的高通量檢測，敏感度達(dá)0 . 1 TCID50，比普通PCR的靈敏度高10倍左右，可直接從無菌性腦炎、手足口病、急性出血性結(jié)膜炎患者的腦脊液、糞便、皰疹液和眼拭子等臨床樣本中檢測腸道病毒核酸，而且核酸陽性的樣本被腸道病毒分離和基因測序的結(jié)果得到進(jìn)一步的證實(shí)。我們用建立的新方法，對近幾年我省疑似腸道病毒感染引起的應(yīng)急疫情進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室早期快速診斷，獲得了令人滿意的結(jié)果。
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【參考文獻(xiàn)】
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【摘要】 目的 建立一種特異、靈敏、快速的熒光定量RT-PCR方法檢測腸道病毒核酸，應(yīng)用于暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測。方法 根據(jù)GenBank登錄的腸道病毒基因序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對，在腸道病毒基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針；對熒光RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證方法的特異性和靈敏度。同時對疑似腸道病毒感染者的臨床樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果 該方法對腸道病毒的檢測有高度的特異性，可檢出脊髓灰質(zhì)炎、柯薩奇和埃可等腸道病毒，與腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、乙型腦炎等病毒均無交叉反應(yīng)。檢測的靈敏度達(dá)0．1病毒效價滴定(TCID50)；可直接從疑似腸道病毒感染者的腦脊液、皰疹液和糞便等標(biāo)本中檢測腸道病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測僅需3h左右。結(jié)論 所建立的TaqMan熒光定量RTPCR是一種快速檢測腸道病毒特異、敏感的方法，適用于由腸道病毒感染引起的應(yīng)急疫情的實(shí)驗(yàn)室早期診斷。
【關(guān)鍵詞】 熒光定量RTPCR；TaqMan探針；腸道病毒；臨床標(biāo)本
腸道病毒(EV)屬于小RNA病毒科，根據(jù)血清學(xué)可以分為脊灰病毒、柯薩奇、�？刹《竞湍c道病毒68～71型，共67個血清型。腸道病毒可引發(fā)眾多疾病，并可暴發(fā)流行，導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重危害人類健康。浙江省近幾年由腸道病毒引起的無菌性腦炎〔1，2〕、手足口病〔3〕、急性出血性結(jié)膜炎和新生兒急性心肌炎等暴發(fā)疫情頻頻發(fā)生。為了迅速查明病因，及時采取控制措施，亟需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速診斷，但腸道病毒傳統(tǒng)的檢測方法是病毒分離和中和法定型，不僅繁瑣費(fèi)時，而且無法對所有的血清型進(jìn)行鑒定，更不能對一些抗原變異株或新型別毒株進(jìn)行鑒定。本研究建立的腸道病毒熒光定量RTPCR方法，為腸道病毒實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測提供了有效的分子生物學(xué)檢測手段。
1.材料與方法:
1.1 病毒標(biāo)準(zhǔn)株與臨床標(biāo)本 脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin Ⅰ～Ⅲ型疫苗株(北京生物制品研究所)；柯薩奇、�？珊湍c道病毒70～71型等標(biāo)準(zhǔn)株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、乙型腦炎等毒株(中國疾病預(yù)防控制中心)。臨床樣本來源于浙江省近幾年各地報告的疑似腸道病毒感染疫情如無菌性腦炎、手足口病、疑似脊髓灰質(zhì)炎和急性出血性結(jié)膜炎等患者的腦脊液、皰疹液、糞便和眼拭子等，樣本采集后常規(guī)送至實(shí)驗(yàn)室。
1.2 引物與探針 從GenBank上下載不同年份和地區(qū)的腸道病毒基因序列，用生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性比較，在5′非編碼保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，序列為EVF：5′CTGYRGCGGAACCGACTAC3′；EVR：5′ATTGTCACCATAAGCAGCCA3′；EVProbe：5′FAMTTGGGTGTCCGTGTTTMGB3′。引物和探針委托上�；瞪锕こ逃邢薰竞铣�。
1.3 病毒定量標(biāo)準(zhǔn)與病毒RNA的提取 以Sabin Ⅲ型疫苗株為標(biāo)準(zhǔn)毒株，用人橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)進(jìn)行病毒效價滴定(107，5TCID50／ml)后作為參考株，將其稀釋TCID50分別為1000，100，10，1，01，001于每個反應(yīng)管。病毒RNA的提取按試劑盒說明書(德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit)。
1.4 熒光RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化 試驗(yàn)在以相同濃度陽性核酸為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從100～900μmol／μl，探針濃度從50～300μmol／μl,采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測，根據(jù)熒光RT-PCR反應(yīng)的最低熒光閾值(Ct值)和最高熒光強(qiáng)度增加值(△Rn)選擇最佳引物和探針濃度。試劑盒采用(AKARA公司)熒光RT-PCR Kit，按試劑盒說明書操作。
1.5 RTPCR反應(yīng) 腸道病毒RT-PCR通用引物參照文獻(xiàn)〔4〕，EV1：5′AAGCACTTCTGTTTCCC3′(166-182)，EV2：5′ATTCAGGGGCCGGAGGA3′(447463)，擴(kuò)增片斷297bp。采用RTPCR試劑盒(美國Roche公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μl。其中5×RTPCR緩沖液4μl，4種脫氧核苷酸(dNTP)混合物(10mmol／L)16μl二硫疏糖醇(DTT)(100mmol/L)10μl,RNase抑制劑(5u/μl)04μl，20μmol／L上游引物與下游引物各0.5 μl，Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶混合物(5u／μl)04μl，模板RNA 10μl，最后用焦碳酸二乙脂(DEPC)水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為50℃ 30min，94℃ 2min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和變性，然后94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 1min進(jìn)行擴(kuò)增，35個循環(huán)后轉(zhuǎn)入68℃ 7min，取8μl產(chǎn)物電泳后判斷有無特異性條帶。
1.6 熒光RTPCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 選擇腸道病毒：脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ～Ⅲ型，柯薩奇病毒A16,A24，B1，B3，B5,埃可病毒7，20，30型和腸道病毒71型，以及選擇容易引起腦炎等癥狀的非腸道病毒，麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、乙腦、登革熱病毒等，對上述2組病毒分別提取核酸，用腸道病毒熒光RTPCR方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證方法的特異性。對已標(biāo)定TCID50的腸道病毒Sab in Ⅲ型(107，5TCID50／ml)稀釋后分別提取RNA，平行進(jìn)行熒光RTPCR與RTPCR反應(yīng)，比較其靈敏度。此外，對每一個濃度的病毒稀釋液作5次重復(fù)檢測，得到的Ct值采用stata80軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。
1.7 統(tǒng)計(jì)分析 熒光RTPCR法的Ct值采用Stata80軟件計(jì)算其±s
2 結(jié)果
2.1 熒光RTPCR反應(yīng)體系及條件 采用一步法熒光RTPCR試劑盒，總反應(yīng)體系為25μl。矩陣法優(yōu)選后引物最佳濃度均為064μmol/L，探針最佳濃度為0.30μmol／L，模板RNA 10μ1，最后用DEPC水補(bǔ)至25μl。用MJ Research Option 2熒光檢測系統(tǒng)或Roche Lightcycle熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，反應(yīng)參數(shù)為：45℃ 30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2?min，以93℃ 15s，60℃ 1min擴(kuò)增40個循環(huán)，在60℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測，可獲得最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度。
2.2 特異性試驗(yàn) 本研究建立的熒光RTPCR方法對腸道病毒具有較好的特異性，可檢測PVl-3，Cox A16、A24、Bl、B3、B5，ECH07、20、30，EV70～71型等不同群的腸道病毒，而與腮腺炎、乙腦、登革熱、麻疹、風(fēng)疹病毒等均無交叉反應(yīng)。
2.3 敏感性試驗(yàn) 對腸道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株，采用RD細(xì)胞進(jìn)行病毒效價測定(107，5TCID50/ml)，然后稀釋成1000，100，10，1，0.1，0.01 TCID50，提取病毒RNA，分別用熒光RT-PCR與常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果熒光RT-PCR方法檢測敏感性達(dá)到0.1 TCID50，比常規(guī)RT-PCR方法的靈敏度1.0 TCID50高10倍左右。
A～E：1000，100，10，1，0.1 TCID50
圖1 熒光PT-PCR法檢測腸道病毒的靈敏度（略）
2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 腸道病毒Sabin Ⅲ型疫苗株按10倍梯度稀釋成4個不同的濃度，對每一個濃度的樣本作5個重復(fù)檢測，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0.23～0.65之間，具有較好的重復(fù)性。
表1 熒光RT-PCR法檢測腸道病毒核酸的重復(fù)性試驗(yàn)（略）
2.5 樣本的檢測 從浙江省各地報告的病毒性腦炎、手足口病、急性出血性結(jié)膜炎和急性心肌炎等等疑似腸道病毒感染疫情患者的腦脊液23份、糞便20份、皰疹液8份和眼拭子7份等臨床樣本中直接提取病毒RNA，用建立的熒光RT-PCR方法檢測腸道病毒核酸。結(jié)果顯示，58份樣本中腸道病毒核酸陽性的有32份。同時對上述樣本采用RD和Hep-2細(xì)胞進(jìn)行腸道病毒分離，結(jié)果病毒分離陽性的24份，其余8份熒光RTPCR方法陽性而病毒分離陰性的樣本，采用腸道病毒通用引物直接從樣本中提取病毒核酸后進(jìn)行1次或2次RTPCR擴(kuò)增相應(yīng)片段、測序和BLAST比對，最終確定為腸道病毒。
3 討論
腸道病毒是最常見感染人類的病毒，可導(dǎo)致多種疾病，臨床表現(xiàn)多樣，近幾年由腸道病毒引起的暴發(fā)疫情時有發(fā)生〔1-3,5〕。對該類疫情盡早作出實(shí)驗(yàn)室確診是及時采取防控措施與對癥治療的關(guān)鍵。近幾年發(fā)展起來的以特異性熒光探針為特點(diǎn)的熒光定量PCR技術(shù)，實(shí)行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會，而且較常規(guī)RTPCR技術(shù)，無診從敏感性、特異性與速度上都更具有優(yōu)勢，當(dāng)然它對引物和探針的設(shè)計(jì)也提出了更高的要求〔6-8〕。我們從美國的NCBI與日本的DDBJ基因庫上下載了近20年來世界各地的腸道病毒株，對其進(jìn)行了同源性比較，在腸道病毒5′端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)若干對引物與Taqman探針，對該區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從中篩選出最佳的引物和探針，并對熒光RT-PC方法進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證其敏感性、特異性和重復(fù)性。經(jīng)腸道病毒標(biāo)準(zhǔn)株與臨床樣本的檢測比較，該方法具有高特異性，能檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ～Ⅲ型、柯薩奇病毒Bl、B3、B5，�？刹《�7、20、30型及新型腸道病毒70～71型等多個血清型別的腸道病毒，與腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、乙腦、登革熱病毒均無交叉反應(yīng)，而且比常規(guī)RTPCR和病毒分離法更敏感、快速和簡便。通常腸道病毒的RTPCR檢測敏感度在1.0 TCID50左右，從病毒核酸提取、RTPCR反應(yīng)與電泳，整個過程大約需6～7h左右，而采用本方法從核酸提取至完成檢測，僅需3h左右，能同時完成多個疑似患者臨床樣本的高通量檢測，敏感度達(dá)0 . 1 TCID50，比普通PCR的靈敏度高10倍左右，可直接從無菌性腦炎、手足口病、急性出血性結(jié)膜炎患者的腦脊液、糞便、皰疹液和眼拭子等臨床樣本中檢測腸道病毒核酸，而且核酸陽性的樣本被腸道病毒分離和基因測序的結(jié)果得到進(jìn)一步的證實(shí)。我們用建立的新方法，對近幾年我省疑似腸道病毒感染引起的應(yīng)急疫情進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室早期快速診斷，獲得了令人滿意的結(jié)果。
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