基因芯片技術(shù)簡介和應(yīng)用展望

基因芯片（Gene Chip）通常指DNA芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量�；�因芯片的概念現(xiàn)已泛化到生物芯片（biochip）、微陣列（Microarray）、DNA芯片（DNA chip），甚至蛋白芯片�；�因芯片集成了探針固相原位合成技術(shù)、照相平板印刷技術(shù)、高分子合成技術(shù)、精密控制技術(shù)和激光共聚焦顯微技術(shù)，使得合成、固定高密度的數(shù)以萬計的探針分子以及對雜交信號進(jìn)行實時、靈敏、準(zhǔn)確的檢測分析變得切實可行�；�因芯片技術(shù)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)臨床檢驗領(lǐng)域、生物制藥領(lǐng)域和環(huán)境醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出了強(qiáng)大的生命力，其中關(guān)鍵就是基因芯片具有微型化、集約化和標(biāo)準(zhǔn)化的特點，從而有可能實現(xiàn)“將整個實驗室縮微到一片芯片上”的愿望�；�因芯片在國內(nèi)外已形成研究與開發(fā)的熱潮，許多科學(xué)家和企業(yè)家將基因芯片同當(dāng)年的PCR相提并論，認(rèn)為它將帶來巨大的技術(shù)、社會和經(jīng)濟(jì)效益，正如電子管電路向晶體管電路和集成電路發(fā)展是所經(jīng)歷的那樣，核酸雜交技術(shù)的集成化也已經(jīng)和正在使分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)生著一場革命。

基因芯片的種類

基因芯片產(chǎn)生的基礎(chǔ)則是分子生物學(xué)、微電子技術(shù)、高分子化學(xué)合成技術(shù)、激光技術(shù)和計算機(jī)科學(xué)的發(fā)展及其有機(jī)結(jié)合。根據(jù)基因芯片制造過程中主要技術(shù)的區(qū)別，下面主要介紹四類基因芯片。

一、光引導(dǎo)原位合成技術(shù)生產(chǎn)寡聚核苷酸微陣列

開發(fā)并掌握這一技術(shù)的是Affymetrix公司，Affymetrix采用了照相平板印刷技術(shù)技術(shù)結(jié)合光引導(dǎo)原位寡聚核苷酸合成技術(shù)制作DNA芯片，生產(chǎn)過程同電子芯片的生產(chǎn)過程十分相似。采用這種技術(shù)生產(chǎn)的基因芯片可以達(dá)到1×106/cm2的微探針排列密度，能夠在一片1厘米多見方的片基上排列幾百萬個寡聚核苷酸探針。

原位合成法主要為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（Light-directed synthesis），它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引導(dǎo)聚合技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。半導(dǎo)體技術(shù)中曾使用照相平板技術(shù)法在半導(dǎo)體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術(shù)是當(dāng)前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術(shù)成熟且已實現(xiàn)自動化。二者的結(jié)合為合成高密度核酸探針及短肽列陣提供了一條快捷的途徑。

Affymetrix公司已有診斷用基因芯片成品上市，根據(jù)用途可以分為三大類，分別為基因表達(dá)芯片、基因多態(tài)性分析芯片和疾病診斷芯片，基因表達(dá)分析芯片和基因多態(tài)性分析芯片主要用于研究機(jī)構(gòu)和生物制藥公司，可以用來尋找新基因、基因測序、疾病基因研究、基因制藥研究、新藥篩選等許多領(lǐng)域，Affymetrix公司主要生產(chǎn)通用寡聚核苷酸芯片；疾病診斷芯片則主要用于醫(yī)學(xué)臨床診斷，包括各種遺傳病和腫瘤等，目前Affymetrix公司生產(chǎn)三種商品化診斷芯片，分別為p53基因突變診斷芯片、艾滋病病毒基因基因突變診斷芯片和細(xì)胞色素P450基因突變診斷芯片。

二、微電子芯片

Nanogen開發(fā)了多位點電控陣列并含獨立可尋址檢測區(qū)域的微電子基因芯片，其基質(zhì)全部以硅、鍺與基礎(chǔ)的半導(dǎo)體材料，在其上構(gòu)建25-400個微鉑電極位點，各位點可由計算機(jī)獨立或組合控制。無論在芯片制造或成品芯片檢測，均可通過相似微電極的電場變化來使核酸結(jié)合，引入“電子嚴(yán)謹(jǐn)度”參數(shù)使芯片檢測通過靶、探針序列特征和使用者要求來控制雜交過程中的嚴(yán)格性。這種微電子基因芯片具有以下優(yōu)點：

1．電場定位過程能選擇性地轉(zhuǎn)運帶電荷DNA分子，通過每個微電極位點的電場正負(fù)、強(qiáng)弱變化，能準(zhǔn)確有效地隨意調(diào)控芯片表面的核酸，既可將核酸結(jié)合在微電極位點上，也可以使核酸轉(zhuǎn)運出來。

2．通過電場變化能加快DNA雜交速率，通過導(dǎo)入正電場后，可以大大加快待測核酸同已知探針的結(jié)合速率，減少了雜交反應(yīng)時間，同普通的“被動”雜交反應(yīng)的幾小時相比，這種“主動”雜交反應(yīng)僅僅幾秒鐘就可完成。另外電場變化又可有效地去除未結(jié)合游離分子，減少未結(jié)合熒光信號干擾。

3．通過電子嚴(yán)謹(jǐn)度可有效地控制雜交過程中的錯配度，雜交錯配的程度，對不同的要求上要給以不同的電場就可以符合不同的電子嚴(yán)謹(jǐn)度，這對核酸雜交嚴(yán)格度可以非常靈活地控制，這可以非常準(zhǔn)確地進(jìn)行SNP檢測。

三、微量點樣技術(shù)
目前大部分生產(chǎn)基因芯片的公司都是使用這一方法，采用了先進(jìn)更加微量的點樣技術(shù)，可以點更加微量的探針。這種方法生產(chǎn)的芯片上探針不受探針分子大小種類的限制，能夠靈活機(jī)動地根據(jù)使用者的要求制作出符合目的的芯片。由于同時有生產(chǎn)和檢測儀器出售，使擁護(hù)能夠根據(jù)自己的需要制作相應(yīng)的芯片，并且價格較低，所以近期內(nèi)國內(nèi)將會有一定的市場。生產(chǎn)這種設(shè)備的公司有很多，象美國的Genomicsolutions公司、英國的BioRobotics公司、美國的Cartesian公司和加拿大的Engineering公司等。

對于微量點樣技術(shù)生產(chǎn)的基因芯片來說從儀器組成上可以分為點樣儀器、雜交裝置、檢測儀器和分析儀器，點樣儀器是否先進(jìn)決定芯片上的探針密度和結(jié)合牢固程度，雖然芯片的探針密度是一個很重要的指標(biāo)，達(dá)到極高密度的探針陣列是許多芯片生產(chǎn)公司夢寐以求的目標(biāo)，但是具體的點樣密度根據(jù)使用者的目的來決定，而且還要考慮到隨后的雜交和檢測過程。衡量點樣裝置有幾個比較重要的指標(biāo)，如儀器整體設(shè)計、功能多樣性、芯片基質(zhì)多樣性、點樣穩(wěn)定性、點樣速度、點樣密度等等。

點陣器一般采用實心或空心點樣針，點樣方式有非接觸噴點（inkjet printing）和接觸點樣（Contact
printing）兩種方式。目前，有兩種非接觸噴點技術(shù)用于DNA點樣，一種是用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術(shù)（piezoelectric technology），噴滴大小一般為50-500pl；另一種為注射器螺線管技術(shù)（syringe-solenoid
technology），這種技術(shù)是通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機(jī)結(jié)合起來精確控制滴液的。

檢測儀器也是一個重要的限制條件，如果檢測儀器的分辨率不高，那么即使點樣儀器制造出了很高密度的芯片也沒有用，對高密度的芯片通常使用激光共聚焦顯微鏡和高性能的冷卻CCD，二者各有利弊，須根據(jù)要求綜合衡量。
顯色和分析測定方法主要為熒光法，目前正在發(fā)展的方法有質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法等。以熒光法為例，當(dāng)前主要的檢測手段是激光共聚焦顯微掃描技術(shù)和高性能的冷卻CCD，以便于對高密度探針陣列每個位點的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。因為探針與樣品完全正常配對時所產(chǎn)生的熒光信號強(qiáng)度是具有單個或兩個錯配堿基探針的5-35倍，所以對熒光信號強(qiáng)度精確測定是實現(xiàn)檢測特異性的基礎(chǔ)。

分析儀器從硬件上說只是一部高性能的計算機(jī)，但其中最重要的是分析軟件，如果只是進(jìn)行簡單的檢測或科學(xué)實驗，待測樣品所要分析的基因很少很簡單，采用直觀的觀察就可以得出結(jié)論，但對于大量的基因分析或是臨床檢驗人員使用就需要有全面智能化的分析軟件輔助，這樣還需要考慮到軟件的升級。

四、其他技術(shù)
主要是美國NIH、Caliper公司和Orchidbio公司等，Orchidbio公司研制了一種毛細(xì)管微流泵芯片，在邊長2英寸的芯片上集成了144個微室，分別由流入孔、反應(yīng)室、循環(huán)管和廢液流出孔組成，這種芯片不但可以用于基因診斷和分析，還可用于合成化學(xué)，利用芯片的微指結(jié)構(gòu)，Caliper公司的芯片可以用作細(xì)胞分選器，能夠利用血細(xì)胞體積和變形性等特點可以很容易地把紅細(xì)胞和白細(xì)胞分開，NIH研制微型芯片反應(yīng)器可以很快地完成一系列生化反應(yīng)。
應(yīng)用領(lǐng)域

一、科研領(lǐng)域
1998年底美國科學(xué)促進(jìn)會將基因芯片技術(shù)列為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一，足見其在科學(xué)史上的意義。它以其可同時、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。這些應(yīng)用主要包括基因表達(dá)檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。采用基因芯片檢測基因表達(dá)的改變能夠節(jié)省大量的人力物力和財力，在以前，科學(xué)家不得不重復(fù)大量的實驗來觀察多個基因的改變情況，如果采用傳統(tǒng)的方法研究細(xì)胞中的上千個基因的改變幾乎是不可想象的，因為必須提取首先提取細(xì)胞的核酸，而且要足夠多以滿足Northern雜交的需要，然后標(biāo)記每一種探針，再分別進(jìn)行雜交檢測。而采用基因芯片則可以使工作量成千上萬倍地減少，利用基因芯片同時檢測了酵母菌中6000個基因的功能，而斯坦福大學(xué)Patrick
Brown領(lǐng)導(dǎo)的科研小組則成果地檢測了人成纖維細(xì)胞中8600個基因的表達(dá)改變。

基因芯片黑可用于基因測序，目前美國人類基因組計劃正在大力發(fā)展這一技術(shù)爭取能替代目前的自動測序，同現(xiàn)有的手工測序和自動測序相比，基因芯片測序能節(jié)省大量的試劑和儀器損耗。在基因表達(dá)檢測的研究上人們已比較成功地對多種生物包括擬南芥、酵母及人的基因組表達(dá)情況進(jìn)行了研究。實踐證明基因芯片技術(shù)也可用于核酸突變的檢測及基因組多態(tài)性的分析，與常規(guī)測序結(jié)果一致性達(dá)到98%等的突變檢測，對人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定、作圖和分型、人線粒體基因組多態(tài)性的研究等。將生物傳感器與芯片技術(shù)相結(jié)合，通過改變探針陣列區(qū)域的電場強(qiáng)度已經(jīng)證明可以檢測到基因的單堿基突變，通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進(jìn)行作圖。雜交測序是基因芯片技術(shù)的另一重要應(yīng)用。該測序技術(shù)理論上不失為一種高效可行的測序方法，但需通過大量重疊序列探針與目的分子的雜交方可推導(dǎo)出目的核酸分子的序列，所以需要制作大量的探針�；�因芯片技術(shù)可以比較容易地合成并固定大量核酸分子，所以它的問世無疑為雜交測序提供了實踐的可能性。

二、生物制藥領(lǐng)域
各大藥廠和生物技術(shù)公司將會使用基因芯片發(fā)現(xiàn)篩選新藥等。采用基因芯片技術(shù)，可以大大加快人類基因組計劃的工作進(jìn)度，例如用于基因測序、基因表達(dá)檢測和新的遺傳標(biāo)志如SNP定位等，這對尋找新的功能基因、尋找新的藥物作用靶點和開發(fā)新的基因藥物具有重要意義。采用基因芯片可以進(jìn)行超乎以前想象的工作量來檢測不同物種、不同組織、不同病種、不同處理條件下的基因表達(dá)改變，從而知道開發(fā)具有不同用途的的診斷試劑盒。新藥在實驗階段必須通過人體安全性實驗，就必須觀察藥物對人基因表達(dá)的影響，由于并不知道藥物對那一種基因起作用，就必須對已知所有或一定范圍內(nèi)的基因表達(dá)都進(jìn)行檢測，采用基因芯片可以迅速而準(zhǔn)確地完成這一任務(wù)，美國Tularick公司曾開發(fā)出一種用于新藥，能夠顯著地降低低密度脂蛋白-一種能引起血管硬化的物質(zhì)，隨后Tularick公司的科研人員采用Syntini公司的基因芯片研究了這種新藥對人體細(xì)胞基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)它能顯著地改變細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜，十分類似有又一種毒性反應(yīng)，Tularick公司只好終止了這種藥物的研發(fā)，由此公司節(jié)省了大量的投資。

三、醫(yī)學(xué)診斷
1、在優(yōu)生方面，目前知道有600多種遺傳疾病與基因有關(guān)。婦女在妊娠早期用DNA芯片做基因診斷，可以避免許多遺傳疾病的發(fā)生。
2、在疾病診斷方面，由于大部分疾病與基因有關(guān)，而且往往與多基因有關(guān)，因而，利用DNA芯片可以尋找基因與疾病的相關(guān)性，從而研制出相應(yīng)的藥物和提出新的治療方法。DNA芯片的高密度信息量和并行處理器的優(yōu)點不僅使多基因分析成為可能，而且保證了診斷的高效、廉價、快速和簡便。
3、應(yīng)用于器官移植、組織移植、細(xì)胞移植方面的基因配型，如HLA分型。
4、病原體診斷，如細(xì)菌和病毒鑒定、耐藥基因的鑒定。
5、在環(huán)境對人體的影響方面，已知花粉過敏等人體對環(huán)境的反應(yīng)都與基因有關(guān)。若對與環(huán)境污染相關(guān)的200多個基因進(jìn)行全面監(jiān)測，將對生態(tài)環(huán)境控制及人類健康有重要意義。
6、在法醫(yī)學(xué)方面，DNA芯片比早先的DNA指紋鑒定更進(jìn)一步，它不僅可做基因鑒定，而且可以通過DNA中包含的生命信息描繪生命體的臉型長相外貌特征。這種檢驗常用于災(zāi)難事故后鑒定尸體身份以及鑒定父母和子女之間的血緣關(guān)系。
由此可見，利用DNA芯片可以快速高效地獲取空前規(guī)模的生命信息，這一特征將使DNA芯片技術(shù)成為今后科學(xué)探索和醫(yī)學(xué)診斷等諸多方面的革命性的新方法、新工具。

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