流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人和小鼠Th細(xì)胞亞群

早在1986年Mosmann等[1]依據(jù)小鼠分泌的細(xì)胞因子譜不同首次將Th細(xì)胞分為Th1和Th2兩個(gè)功能不同的獨(dú)立亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等細(xì)胞因子，介導(dǎo)與細(xì)胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏反應(yīng)。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等細(xì)胞因子，其主要功能為刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，與體液免疫相關(guān)。由于Th1/Th2 亞群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用，Th1/Th2 平衡的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有著密切的關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)許多感染性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病以及移植排斥反應(yīng)等都與Th1/Th2 平衡有關(guān)。因此建立穩(wěn)定有效的細(xì)胞內(nèi)因子檢測(cè)方法對(duì)于準(zhǔn)確說明Th1/Th2細(xì)胞的作用非常重要。目前檢測(cè)的主要方法有酶聯(lián)免疫法、ELISPOT法、熒光定量法及原位雜交等方法。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子是一種相對(duì)快速、重復(fù)性好并能準(zhǔn)確定量的方法。我們參照國(guó)內(nèi)外的一些文獻(xiàn)，對(duì)于人和小鼠Th1和Th2細(xì)胞的流式檢測(cè)方法進(jìn)行了探索，并比較了兩者之間的不同。

由于未活化的淋巴細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子極少，用流式細(xì)胞儀很難檢測(cè)出來，因此在檢測(cè)前需刺激活化。目前國(guó)內(nèi)外推薦的刺激物主要為PMA （佛波酯）和離子霉素（Ionomycin）。
淋巴細(xì)胞在刺激物的作用下活化，分泌細(xì)胞因子到細(xì)胞外。由于流式細(xì)胞儀只能對(duì)細(xì)胞表面或內(nèi)部的抗原進(jìn)行檢測(cè)，因此必須阻止細(xì)胞因子的分泌。抑制細(xì)胞因子分泌的試劑為Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。Th1/Th2 細(xì)胞首先是CD4+ T淋巴細(xì)胞。因此如何確定CD4+ T淋巴細(xì)胞非常重要，我們主要圍繞該問題進(jìn)行探討。

材料與方法
試劑
PMA（Sigma）
貯存液：PMA 溶于DMSO 濃度為0.1mg/ml -20℃ 保存。
工作液：貯存液1:100 稀釋于RPMI 1640培養(yǎng)基中，此時(shí)為1µg/ml。
Ionomycin（Sigma）
貯存液：Ionomycin 溶于DMSO 濃度為1mg/ml -20℃ 保存。
工作液：貯存液1:20 稀釋于RPMI 1640 培養(yǎng)基中，此時(shí)為50µg/ml。
GolgiStop（內(nèi)含Monensin ，BD Pharmingen）
Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution，均購(gòu)自BD Pharmingen。

抗體
細(xì)胞表面標(biāo)記抗體：抗人CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC�？剐∈驝D4-CYC、CD8PE。
細(xì)胞內(nèi)因子抗體：抗人IL-4-PE, IFN-γ-FITC�？故驣L-4-PE, IFN-γ-FITC。以上抗體均購(gòu)自BD Pharmingen。

實(shí)驗(yàn)方法
1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。在試管內(nèi)加入淋巴細(xì)胞分離液3ml。將外周血以等體積Hanks液稀釋后，輕輕加入淋巴細(xì)胞分離液上層。2000g離心20min。取出試管后，輕輕吸取液相交界的單個(gè)核細(xì)胞，加入Hanks液3ml，混勻后，1500g離心5min。棄去上清，細(xì)胞加入0.5ml
RPMI 1640培養(yǎng)基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin 和50μg/ml
steptomycin）重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。

2 不同濃度的PMA刺激后人T淋巴細(xì)胞CD4、CD8和CD3的表達(dá)。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，加入RPMI 1640培養(yǎng)基至總體積1ml。加入不同濃度的PMA（10ng、20ng和50ng終濃度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)加入0.7µl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集單個(gè)核細(xì)胞，分為三部分，分別加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC單抗各10ul，室溫避光孵育30min。加入紅細(xì)胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解殘余紅細(xì)胞，2ml PBS洗滌細(xì)胞一次。流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，Becton Dickinson)檢測(cè)細(xì)胞，Cellquest軟件獲取分析細(xì)胞，每個(gè)檢測(cè)獲取10000個(gè)細(xì)胞。采用前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以直方圖分別表示CD3、CD8和CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞。

3 不同時(shí)間PMA和離子霉素刺激后小鼠T淋巴細(xì)胞CD4和CD8的表達(dá)。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，加入RPMI 1640培養(yǎng)基至總體積1ml。加入PMA和Ionomycin使終濃度分別為100ng/ml和1µg/ml，同時(shí)加入0.7µl Golgistop。37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h分別收集細(xì)胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗體標(biāo)記T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4和CD8的表達(dá)。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人外周血Th1和Th2細(xì)胞。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml
離子霉素刺激4h后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞分為兩份，稱為對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管，分別加入CD3-APC，CD8-PercP10µl，混勻，室溫放置20min，加入紅細(xì)胞裂解液1ml，混勻，室溫放置10min，1000g離心5min，棄上清。加入Cytofix/Cytoperm液200µl，4℃放置20min，使細(xì)胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml，1500g離心5min，棄上清。實(shí)驗(yàn)管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5ul，對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體，4℃避光孵育30min。加入Perm/Wash液500µl洗滌兩次。最后以300µl洗滌液重懸細(xì)胞。采用FACScom軟件及CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗體單雙標(biāo)記的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)儀器的補(bǔ)償，采用Cellquest軟件獲取分析細(xì)胞。以前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD3和CD8散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞（CD3+CD8-）。最終以IFN-γ和IL-4的散點(diǎn)圖表示Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血Th1和Th2細(xì)胞。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入100ng/ml PMA和1µg/ml 離子霉素刺激5h后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞分為兩份，稱為對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管，加入CD4－CYC 10µl，混勻，其余步驟同人的檢測(cè)。調(diào)節(jié)儀器的補(bǔ)償，采用Cellquest軟件獲取分析細(xì)胞。以前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散點(diǎn)圖表示Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。

結(jié)果

1 不同濃度的PMA對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的影響。10ng、20ng和50ng的PMA刺激后4h，CD4的表達(dá)明顯下降，已經(jīng)不能區(qū)分出CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞，而CD8和CD3的表達(dá)未受明顯影響。重復(fù)5次檢測(cè)，典型的檢測(cè)結(jié)果見圖1。


圖1 10ng、20ng、50ng PMA和500ng/ml Ionomycin共同刺激4h后人外周血T淋巴細(xì)胞CD4、CD8和CD3的表達(dá)。

圖中A、B、C系列分別是10ng、20ng、50ng PMA刺激后CD4、CD8和CD3的表達(dá)。各種濃度的PMA刺激后均不能有效的區(qū)分CD4陰性和CD4陽(yáng)性細(xì)胞，而CD3和CD8的表達(dá)受影響很小，可以有效的區(qū)分陰性和陽(yáng)性細(xì)胞。

2 不同時(shí)間的PMA刺激對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的影響。PMA刺激8h后CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)沒有明顯下降。PMA刺激12h后，CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)明顯下降。而CD8表達(dá)在8h和12h均沒有明顯下降。典型的檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2
不同時(shí)間的PMA刺激對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的影響。PMA刺激8h后T淋巴細(xì)胞CD4的表達(dá)有輕度下降，但是仍能有效的區(qū)分CD4陰性和CD4陽(yáng)性細(xì)胞。PMA刺激12h后，CD4陽(yáng)性的表達(dá)明顯下降。而CD8表達(dá)在8h和12h均沒有明顯下降。

3 正常人外周血Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。采用CD3+CD8-的T淋巴細(xì)胞為Th細(xì)胞，設(shè)門分析Th1細(xì)胞（IFN-γ+）和Th2細(xì)胞（IL-4+）的百分比。典型檢測(cè)結(jié)果見圖3。

圖3
流式細(xì)胞儀檢測(cè)人外周血Th1和Th2細(xì)胞。A為FSC和SSC的散點(diǎn)圖，R1區(qū)為淋巴細(xì)胞區(qū)；B為CD3和CD8的散點(diǎn)圖，R2區(qū)為Th細(xì)胞（CD3＋CD8－），R3區(qū)為Tc細(xì)胞（CD3＋CD8＋）。C為以“R1 and R2”設(shè)門，IL-4和IFN-γ的散點(diǎn)圖， IFN-γ＋和IL-4＋細(xì)胞分別為Th1和Th2細(xì)胞。D為以“R1 and R3”設(shè)門，IL-4和IFN-γ的散點(diǎn)圖。

4 正常Balb/c小鼠外周血Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。采用CD4＋淋巴細(xì)胞為Th細(xì)胞，設(shè)門分析Th1細(xì)胞（IFN-γ+）和Th2細(xì)胞的百分比（IL-4+）。典型檢測(cè)結(jié)果見圖4。

圖4 小鼠外周血Th1、Th2細(xì)胞。A為CD4直方圖，R2為CD4＋細(xì)胞，B為IL-4和IFN-γ的散點(diǎn)圖。

從Rostaing等[2]發(fā)表流式細(xì)胞術(shù)檢細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的方法后，陸續(xù)有人研究了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子方法的可行性及重復(fù)性等問題。雖然活化T淋巴細(xì)胞有各種各樣的方法，如：PMA、PHA、Con A、CD3、CD2和CD28等。但是目前公認(rèn)的較好的方法仍然是PMA和鈣離子載體的聯(lián)合刺激。研究發(fā)現(xiàn)在PMA的刺激后4h，IFN-γ和IL-4的表達(dá)就達(dá)到一個(gè)較高的水平，因而適合進(jìn)行流式檢測(cè)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人的外周血T淋巴細(xì)胞表面的CD4表達(dá)受PMA的影響非常大，在刺激后2h即明顯下降，4h已經(jīng)難于區(qū)分CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞，因此這就難于確定Th細(xì)胞。雖然國(guó)內(nèi)部分學(xué)者認(rèn)為在PMA的刺激下，CD4仍可以維持一定的表達(dá)[3,4]，但是我們的結(jié)果和國(guó)內(nèi)部分[5]及國(guó)外的大多數(shù)[2,6]研究結(jié)果表明，在PMA的刺激下，CD4表達(dá)迅速下調(diào)，此時(shí)采用CD4來標(biāo)記Th細(xì)胞已經(jīng)不能準(zhǔn)確的檢測(cè)Th細(xì)胞，因而不能準(zhǔn)確的反應(yīng)Th1和Th2細(xì)胞的比率。而CD3和CD8的表達(dá)受PMA等刺激因子的影響很小，因此，目前，國(guó)外推薦的方法是采用CD3和CD8設(shè)門，區(qū)分CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞。由于多色熒光標(biāo)記流式檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，筆者認(rèn)為采用4色標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)人Th細(xì)胞是目前最好的方法。這種方法可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)檢測(cè)管，同時(shí)觀察Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞；可以檢測(cè)CD8＋細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)因子的表達(dá)；還可以觀察IL-4和IFN-γ雙陽(yáng)性細(xì)胞。一個(gè)檢測(cè)管同時(shí)染色，節(jié)約了抗體和勞動(dòng)量等檢測(cè)成本。但是由于多色染色技術(shù)對(duì)流式的操作者有較高的要求，實(shí)施過程要注意補(bǔ)償調(diào)節(jié)等具體問題，我們?cè)��?jīng)采用CYC標(biāo)記的CD8和APC標(biāo)記的CD3聯(lián)合設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞，由于CYC和APC在BD公司的流式細(xì)胞儀上，儀器的補(bǔ)償調(diào)節(jié)非常困難，最終放棄該方法，改用PerCP標(biāo)記的CD8才解決這一問題。目前，國(guó)內(nèi)一些流式細(xì)胞儀型號(hào)相對(duì)落后，不能進(jìn)行4色染色標(biāo)記技術(shù)，筆者認(rèn)為可以采用雙管標(biāo)記檢測(cè)法，即采用CD3、CD8和IFN-γ3色標(biāo)記一管用于檢測(cè)Th1細(xì)胞；采用CD3、CD8和IL-4 3色標(biāo)記一管用于檢測(cè)Th2細(xì)胞。采用這種方法的缺陷是每個(gè)樣品檢測(cè)管數(shù)增加，造成檢測(cè)成本增高，而且不能同時(shí)觀察IL－4和IFN-γ雙陽(yáng)性細(xì)胞。國(guó)外有報(bào)道采用IFN-γ、IL-4和CD3進(jìn)行3色標(biāo)記[7]，這種方法只能觀察T淋巴細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子的變化，不能區(qū)分CD4＋和CD8＋細(xì)胞，筆者認(rèn)為是一種不可取的方法。

我們?cè)贐alb/c小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在PMA的刺激下，CD4表達(dá)雖然下調(diào)，但是其表達(dá)持續(xù)時(shí)間比人的持續(xù)時(shí)間明顯增長(zhǎng)，在刺激8h后，仍然能維持一個(gè)較高的水平，因而能夠有效的區(qū)分Th細(xì)胞。因此，在Balb/c小鼠采用CD4和IFN-γ、IL-4進(jìn)行3色標(biāo)記技術(shù)就能有效的檢測(cè)Th細(xì)胞亞群。當(dāng)然由于CD3和CD8的表達(dá)受PMA的影響很小，采用CD3、CD8和IFN-γ、IL-4進(jìn)行4色標(biāo)記技術(shù)也非常有效。另外，由于CD4不僅在T細(xì)胞上表達(dá)，還在單核細(xì)胞上表達(dá)，單獨(dú)用CD4設(shè)門容易受單核細(xì)胞的干擾，解決這個(gè)問題的一個(gè)辦法就是采用FSC和SSC散點(diǎn)圖來設(shè)門區(qū)分單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，采用CD4直方圖區(qū)分CD4陰性和陽(yáng)性細(xì)胞，最后采用既位于淋巴細(xì)胞區(qū)，有位于CD4＋區(qū)的細(xì)胞來定義為Th細(xì)胞，這樣可以有效的避免單核細(xì)胞的干擾。當(dāng)然采用4色標(biāo)記也是一種非常有效的避免單核細(xì)胞干擾的方法。

由于T淋巴細(xì)胞表達(dá)的因子非常多，檢測(cè)其它細(xì)胞因子可以參照檢測(cè)IL-4和IFN-γ的方法進(jìn)行。凡是采用PMA等作為刺激劑的檢測(cè)方法均應(yīng)考慮到PMA等刺激劑對(duì)于細(xì)胞表面抗原表達(dá)的影響，從而選擇最佳的熒光抗體標(biāo)記，這是進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)的基礎(chǔ)。

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