ABI Prism 7000型定量PCR儀中文操作手冊(cè)

1、新建文件菜單File → New，Assay選擇Absolute Quantification（實(shí)時(shí)定量模式），打開一個(gè)空白的96孔板文件。
2、探針設(shè)置雙擊任意一個(gè)孔，打開Well Inspector窗口。該窗口也可以從菜單View → Well Inspector打開。
3、首次使用軟件，或者探針（Detector）沒有設(shè)置好，請(qǐng)點(diǎn)擊Add Detector按鈕，打開Detector
Manager窗口。該窗口也可以從菜單Tools → Detector Manager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針，點(diǎn)擊按鈕File →
New，新建探針：設(shè)定探針的名稱（建議使用所研究基因符號(hào)加標(biāo)記熒光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等）、報(bào)告基團(tuán)（FAM或者VIC）、淬滅基團(tuán)（TaqMan探針選TAMRA；MGB探針選None）、顏色（任意指定）等。設(shè)置完成后點(diǎn)擊OK，該探針即出現(xiàn)在探針列表中。重復(fù)此過程，設(shè)立其他的探針。
4、在Detector Manager窗口，從探針列表中點(diǎn)擊選擇所需探針，按住Ctrl鍵可以選擇多個(gè)探針，再點(diǎn)擊Add to Plate
Document按鈕。最后點(diǎn)擊Done關(guān)閉Detector Manager窗口。此時(shí)Well Inspector窗口仍然是打開的。
5、填樣品表在96孔表中選定有樣品的一個(gè)或多個(gè)孔，在Well Inspector頁面的Sample
Name欄中填入樣品名稱；在探針列表的Use項(xiàng)下的方框中，打鉤選擇要用的一個(gè)或多個(gè)探針；在Task欄中選擇指定樣品類領(lǐng)：陰性對(duì)照選NTC；未知樣品選Unknown；標(biāo)準(zhǔn)品選Standard。對(duì)于Standard，還要在Quantity欄中輸入DNA拷貝數(shù)。注意：只有在這里輸入拷貝數(shù)后，軟件才能自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。建議標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在5點(diǎn)以上。建議每個(gè)樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)都按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求作一定數(shù)量的復(fù)管。
6、參比熒光如果使用的是ABI公司的定量PCR試劑，如TaqMan Universal PCR Master Mix或者SYBR Green PCR
Master Mix等，參比熒光（Passive
Reference）選ROX；如果使用的試劑中不含有參比熒光，請(qǐng)選None。完成后點(diǎn)擊右上角的X按鈕，關(guān)閉Well Inspector窗口。
7、循環(huán)參數(shù)切換到Instrument頁面，設(shè)定及修改PCR熱循環(huán)程序：在ABI公司默認(rèn)的程序中，50℃ 2
min是UNG酶起作用的步驟，UNG酶可以預(yù)防PCR產(chǎn)物（其中以U代替T）對(duì)定量PCR的污染；95℃ 10
min的作用是激活金牌Taq酶，同時(shí)滅活UNG酶；40個(gè)循環(huán)的95℃ 15 sec和60℃ 1
min是定量PCR的循環(huán)步驟。7000默認(rèn)在最后一步，也就是60℃ 1
min復(fù)性和延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。如果使用ABI公司的定量PCR試劑，上述參數(shù)不需要調(diào)整，直接運(yùn)行PCR循環(huán)就可以了。在使用其他廠家試劑的情況下，如果其中沒有UNG酶，請(qǐng)刪除50℃
2 min步驟；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶，請(qǐng)刪除95℃ 10 min步驟。
8、循環(huán)參數(shù)的修改方法刪除：按住Shift鍵并在相應(yīng)的Stage或Step中點(diǎn)擊，使該步驟被選中變黑，再按Del鍵即可刪除。插入：在需要插入?yún)��?shù)的位置點(diǎn)擊，出現(xiàn)粗黑豎線后，分別點(diǎn)擊Add
Hold、Add Cycle或Add
Step按鈕添加保溫、循環(huán)或循環(huán)中的一個(gè)步驟。修改溫度和時(shí)間：拖動(dòng)鼠標(biāo)，選中需要修改的溫度或時(shí)間數(shù)字，輸入新的數(shù)值即可。
9、其他設(shè)置反應(yīng)體積：定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積是50 µL；如果想修改的話，建議大于25 µL。融解曲線試驗(yàn)：在Dissociation
Protocol選項(xiàng)左邊的方框中打鉤，儀器即在定量PCR循環(huán)完成后繼續(xù)做融解曲線試驗(yàn)。如果是采用SYBR Green
I染料方法進(jìn)行定量研究，建議進(jìn)行融解曲線試驗(yàn)，以判定PCR反應(yīng)特異與否。單峰表示單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，多峰表示PCR擴(kuò)增有雜帶。注意：只有SYBR
Green I染料方法才需要進(jìn)行融解曲線試驗(yàn)，TaqMan探針和MGB探針法都不需要。9600
Emulation：選中此項(xiàng)，即可使7000的升降溫速度減慢，與9600和7700一樣，從而可以直接使用在9600、7700型PCR儀上優(yōu)化好的循環(huán)條件，而不需任何修改。
10、啟動(dòng)擴(kuò)增點(diǎn)Save按鈕保存文件設(shè)置。確認(rèn)96孔板或全部樣品管在主機(jī)內(nèi)放置妥當(dāng)后，點(diǎn)擊Start按鈕，開始PCR循環(huán)。屏幕上動(dòng)態(tài)顯示PCR進(jìn)程和剩余時(shí)間。
11、監(jiān)控進(jìn)程切換到Results頁面的Amp
Plot子頁面，可以實(shí)時(shí)顯示PCR曲線隨著循環(huán)增加而逐步增長(zhǎng)的實(shí)際情況。如果Detector選FAM或VIC，只顯示對(duì)應(yīng)探針的變化情況；如果選All，則同時(shí)顯示所有探針的反應(yīng)進(jìn)程。
12、保存結(jié)果程序結(jié)束后，點(diǎn)Disconnect按鈕，然后File →
Save保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果�？梢员４鏋�.sds格式，也可以保存為.sdt格式，作為以后同類實(shí)驗(yàn)的模板，節(jié)省軟件設(shè)置時(shí)間。