熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

蛋白質(zhì)或其他分子在活細胞內(nèi)互相結(jié)合的時間和地點是了解它們功能的關(guān)鍵問題。要回答這一問題，需將蛋白質(zhì)標上不同的熒光團。但是，光學顯微鏡的分辨率將蛋白質(zhì)檢測精度限制在大約0.2μm左右。要研究蛋白質(zhì)成分的相互物理作用，需要高的分辨率。

FRET就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10 nm）時，將光子能從一個受激發(fā)的熒光團（供體）轉(zhuǎn)移到另一個熒光團（受體）。 采用FRET，可以解決超過光學顯微鏡分辨率限制的分子相對鄰近度問題，來顯示（例如）
（1）二個蛋白質(zhì)成分間分子相互作用；
（2）一個分子內(nèi)部（如酶活動能力、DNA/RNA形態(tài)）的結(jié)構(gòu)變化；
（3）采用象CFP-YFP Cameleon這樣特別的FRET-工具的離子濃度

CFP受光激發(fā)后便發(fā)射光                              CFP受光激發(fā)后但沒有發(fā)射小光。

CFP離YFP的距離大于10nm                         CFP與YFP非常接近（1-10 nm）

YFP沒有受到激發(fā)，因此也不發(fā)射光              CFP沒有受光激發(fā)，但發(fā)射光

 

受激發(fā)后的熒光團（供體）將受激發(fā)的靜能轉(zhuǎn)移到一個光吸收分子（受體）。這種能的轉(zhuǎn)移是非放射性的，其主要原因是供體和受體之間的偶極-偶極間的相互作用。通過雙偶極反應(yīng)，一個處于激發(fā)態(tài)的供體以非激發(fā)方式將能量傳遞給旁邊的受體。 這一理論基于將被激發(fā)熒光分子看成振蕩偶極子，能夠和有同一震蕩頻率的另一個偶極子發(fā)生能量交換。

只有幾個熒光團對才適合FRET實驗，因為，除了其他必要條件（如偶極子定向、足夠的熒光壽命），供體放射光譜必須將受體的激發(fā)光譜重疊起來。已知的FRET對是CFP/YFP、BFP/GFP、GFP/諾丹明、FITC/Cy3

 

CFP/YFP FRET能量圖:

CFP（供體）受到激發(fā)，但是大多數(shù)能量不會引起青綠色放射體；而是被傳送到Y(jié)FP（受體）；因此，所產(chǎn)生的放射體主要是黃色的。

 

象綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）這樣的熒光蛋白質(zhì)（FPs）對FRET實驗非常有吸引力。它們可以以基因方法被融合到有關(guān)蛋白質(zhì)中去并且用細胞表達，使它們成為基因表達和蛋白質(zhì)在活細胞中本地化的極好報告系統(tǒng)�？梢蕴峁┎煌�光譜特性的增強型FP變異。

用青綠色的CFP作供體、黃色的YFP作受體是最適合做活細胞FRET實驗的，因為CFP放射光譜部分重疊了YFP激發(fā)光譜。

當它們足夠接近時，用CFP的吸收波長激發(fā)，CFP的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏[1-2 ]。例如要研究兩種蛋白質(zhì)a和b間的相互作用，可以根據(jù)FRET原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白質(zhì)b、 YFP(yellow fluorescent protein)。用CFP吸收波長433nm作為激發(fā)波長，實驗靈巧設(shè)計，使當?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒有發(fā)生相互作用時，CFP與YFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是CFP的發(fā)射波長為476nm的熒光；但當?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是YFP的發(fā)射波長為527nm的熒光(圖1)。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細胞內(nèi)表達，這樣就可以在活細胞生理條件下研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用。