淺談RT-PCR實驗方法中常見污染問題及對策

李軻反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，它具有特異、敏感、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，能在幾個小時內(nèi)完成從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的目的產(chǎn)物供分析研究和檢測鑒定，所以近年來RT-PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人和動物的多種傳染病早期診斷。

筆者一直從事實驗室動物疫病檢測工作，現(xiàn)就應(yīng)用RT-PCR實驗方法過程中出現(xiàn)的一些常見污染問題做如下論述，僅共同行參考和探討。 RT-PCR實驗有三步：提取RNA、反轉(zhuǎn)錄（RT）、PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物分析，在這一過程中，最令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性。

污染原因主要有以下幾個方面： 

1、樣品間的交叉污染收集樣品的容器最好使用一次性的，如重復(fù)使用，應(yīng)在使用前應(yīng)于180℃的高溫下干烤6小時或更長時間；樣品存放時要密封嚴(yán)實，以防外溢造成相互間的交叉污染；樣品在提取過程中離心管及吸樣槍頭最好使用一次性的，以免不同實驗樣品間相互污染；由于吸樣槍污染會導(dǎo)致樣品間的污染，也是一個值得注意的問題，由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取時要十分小心，吸時要慢，吸取盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染；同時要注意操作時不要劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時也容易造成氣溶膠污染。若產(chǎn)生氣溶膠較多，會造成環(huán)境污染，不僅會導(dǎo)致實驗失敗，而且也會損害操作人員身體健康，因此每次實驗完畢都要及時清理實驗臺面，用0.5%次氯酸鈉消毒后再打開紫外燈照射半小時。 

2、RT-PCR本身使用的試劑污染在試劑配制過程中，由于加樣槍、容器及其它溶液被污染。因此所有試劑都應(yīng)盡量小量分裝，以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會，另外RT-PCR試劑應(yīng)盡可能密封好分類存放。每次操作完畢后同樣要進(jìn)行臺面消毒和紫外線照射消毒。 

3、擴(kuò)增產(chǎn)物的污染這是實驗中最常見的問題，極微量的擴(kuò)增產(chǎn)物污染就可造成假陽性，每次實驗完后，擴(kuò)增產(chǎn)物都要及時密封后處理。在做RT-PCR實驗時，一般都應(yīng)設(shè)陽性對照，操作不慎，污染可能性很大，因而當(dāng)某一RT-PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員經(jīng)驗豐富心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照，或間隔性設(shè)陽性對照，以減少污染機(jī)會。 

4、操作人員污染只要存在少量的RNA酶就會引起RNA的降解，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，RNA酶可存在操作人員手汗、唾液中，也可灰塵中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成實驗失敗，因此操作人員應(yīng)戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換，。設(shè)置PCR操作專用實驗室，所用實驗用具應(yīng)為專用，并合理分隔實驗室，將樣品的提取、配制RT-PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增等步驟分室進(jìn)行，實驗前應(yīng)將實驗室及實驗人員工作服用紫外線或臭氧消毒以破壞殘留的DNA或RNA。任一種科學(xué)的實驗方法都有其自身完善和發(fā)展的過程，RT-PCR方法也不例外，在檢測質(zhì)量能保證的情況下，若能簡化樣品提取步驟或縮短其時間，減少擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，都能對防止污染有利。

總之，RT-PCR不管從特異性方面還是從靈敏性方面講都具有難以匹敵的優(yōu)勢，結(jié)果的可靠性和可信性應(yīng)該是最好的，是較具權(quán)威性的檢測方法，我們期待著它能盡快地自身完善和發(fā)展。