DNA斑點(diǎn)雜交方法

斑點(diǎn)雜交（Dot blot）是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。

　�。�1）DNA斑點(diǎn)雜交：

　　①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

　�、趯�DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

　�、塾勉U筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,每個(gè)樣品一般點(diǎn)5μl(2~10μg DNA)。

　　④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?

　　（2）RNA斑點(diǎn)雜交：與上法類似，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5μl

　　DEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。

　�。�3）完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類似檢測(cè)細(xì)菌菌落的方法，可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測(cè)，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測(cè)。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗�使�?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。

　　斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)

　　【實(shí)驗(yàn)原理】用地高辛標(biāo)記的HCV RNA探針檢測(cè)HCV RT-PCR產(chǎn)物。

　　【實(shí)驗(yàn)步驟】

　　1. 處理：將尼龍膜浸泡于20×SSC中吸足液體后，夾在兩層濾紙中37℃烘烤20—30 min。（將尼龍膜置入烤箱后立即進(jìn)行下一步操作）

　　2. 變性：將待測(cè)DNA樣品（HCV經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；HBV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為陰性對(duì)照，每組兩種樣品各10μL）置于PCR儀中100℃加熱10min，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中驟冷5min。

　�。�每一排共三組的樣品點(diǎn)在同一張尼龍膜上）

　　【原理】 使DNA樣品變性，即雙鏈DNA→單鏈DNA。

　　3. 點(diǎn)樣：將上述變性后的樣品各2μL點(diǎn)在尼龍膜的毛面上，室溫下風(fēng)干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

　　【原理】 使樣品中的DNA與膜結(jié)合牢固。

　　4. 預(yù)雜交：將雜交膜封入雜交袋中（每?jī)山M的膜背靠背封在一個(gè)雜交袋中），做好剪角標(biāo)記（勿過大）。用1000μL加樣器，加入預(yù)雜交液（Dig Easy Hyb），每組5mL全部加完，使尼龍膜恰恰漂起即可，若5mL預(yù)雜交液不足，可適當(dāng)補(bǔ)加。除去氣泡，置42℃恒溫?fù)u床上，輕輕振搖30min-60min。

　　【原理】 封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)。

　　5. 雜交液制備：用預(yù)雜交液將探針按100ng/mL濃度稀釋，即為雜交液。

　　（已準(zhǔn)備好）

　　6. 雜交：剪開雜交袋一個(gè)小角，傾去預(yù)雜交液，加入雜交液2-3mL，除去氣泡，封口。置50℃恒溫?fù)u床上，輕輕振蕩過夜。

　　7. 洗膜：（1）回收雜交液；

　�。�2）室溫下，用2×wash solution洗膜兩次，每次5min；

　�。�3）將0.1×wash solution預(yù)熱到50℃洗膜兩次，每次15min。

　　【原理】洗去未結(jié)合的探針，否則會(huì)導(dǎo)致過高的本底。

　　8. 封閉：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培養(yǎng)皿中浸泡1分鐘平衡后，轉(zhuǎn)入30mL BufferⅡ中，室溫作用30-60min。

　　【原理】封閉雜交膜上非特異性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

　　（在此階段末期，準(zhǔn)備下一步的抗體稀釋。稀釋方法：加1μL Anti-DIG-AP到10mL BufferⅡ后輕輕混勻，4℃ 可保存12h。）

　　9. 酶聯(lián)抗體結(jié)合：將雜交膜封入一個(gè)新的雜交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室溫作用30min，經(jīng)常搖動(dòng)，使酶聯(lián)抗體與地高辛結(jié)合。

　　10.洗膜：（1）取出膜，將膜放入含有30mL BufferⅠ的培養(yǎng)皿中，洗膜兩次，每次15min。

　　【原理】洗去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體。

　�。�2）取出膜，將膜放入含有20mL BufferⅢ的培養(yǎng)皿中平衡2min。

　　11.顯色：（1）將45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL BufferⅢ中，顯色液必需現(xiàn)配現(xiàn)用！

　�。�2）在10mL新鮮制備的顯色底物液中靜止避光顯色數(shù)小時(shí)，常在12h內(nèi)完成顯色反應(yīng)。

　　

　　核酸雜交法檢測(cè)病原微生物

　　核酸雜交技術(shù)是根據(jù)兩條互補(bǔ)的核苷酸單鏈可以雜交結(jié)合成雙鏈的原理所建立，用一段已知序列的放射性或非放射性標(biāo)記的核苷酸單鏈做探針，與待檢標(biāo)本中的DNA雜交來探查待檢標(biāo)本中有無與之相互補(bǔ)的核酸。該方法特異性高，但敏感性低于PCR方法。

　　本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用非放射性標(biāo)記物-地高辛(DIG)標(biāo)記DNA片段作探針，用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)病原微生物DNA的方法。

　　 【原理】

　　用地高辛（DIG）類固醇半抗原標(biāo)記特異DNA片段做探針，與待檢標(biāo)本中DNA雜交，然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗－DIG抗體（抗DIG-AP），再加入堿性磷酸酶的作用底物（NBT/BCIP），若待檢標(biāo)本中有與探針同源的DNA序列，則探針與其雜交并與抗DIG-AP結(jié)合，堿性磷酸酶催化底物呈色，則在雜交膜上出現(xiàn)蘭色斑點(diǎn)或條帶。該探針可用于斑點(diǎn)雜交，菌落原位雜交及Southern blot雜交。

　　�。ㄒ唬〥IG-DNA探針的制備（隨機(jī)引物法標(biāo)記）

　　　【材料】

　　　　1. 待標(biāo)記DNA (0.5~3ug)

　　　　2. 六核苷酸混合物 ( hexanucleotide mix)

　　　　3. dNTP標(biāo)記混合物，Klenow enzyme

　　　　4. 其它試劑4M LiCl，無水乙醇，TE溶液（10mMTris-HCl，lmM EDTA PH8.0）；0.2M EDTA pH8.0

　　　【方法】

　　　　1. 取待標(biāo)記DNA(0.5~3ug)，加無菌去離子水至終體積15ul，于沸水浴變性10分鐘后迅速置冰／氯化鈉中冷卻。

　　　　2. 在冰／氯化鈉上添加：

　　　　2ul 六核苷酸混合物( hexanucleotide mix)

　　　　2ul dNTP mix

　　　　1ul Klenow enzyme

　　　　3. 混勻并短暫離心，然后于37℃孵育至少60分鐘。

　　　　4. 加入2ul 0.2M EDTA，pH8.0以中止反應(yīng)。

　　　　5. 加入2.5ul 4M LiCl及75ul經(jīng)-20℃預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻， -70℃放置30分鐘或-20℃放置2h。

　　　　6. 12000rpm/min離心15min，用50ul預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀物。

　　　　7. 真空短暫干燥，用50ulTE溶液溶解沉淀。

　　　【說明】

　　　　DIG標(biāo)記的DNA片斷大小為200~1000bp。每次標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記反應(yīng)模板DNA量為0.5~3ug，如標(biāo)記大量DNA需相應(yīng)增加反應(yīng)物和反應(yīng)體積。若延長(zhǎng)37℃孵育時(shí)間(到20h)可增加DIG標(biāo)記產(chǎn)物量。

　　　　（二）斑點(diǎn)雜交法

　　　【材料】

　　　　1. 硝酸纖維素膜，待檢標(biāo)本DNA

　　　　2. 標(biāo)準(zhǔn)預(yù)雜交液（5× SSC；0.1％月桂酸；0.02％SDS；1／10體積的10倍濃縮阻斷液(含變性并剪切的鮭精DNA)。

　　　　3. 洗液1（2×SSC，0.1%SDS）; 洗液2 (0.1×SSC，0.1 %SDS)。

　　　【方法】

　　　　1. 雜交膜的制備

　　　　①將從待檢標(biāo)本提取的核酸（質(zhì)�；� 染色體DNA）100℃ 10 min 煮沸變性，迅速置冰／氯化鈉中冷卻。

　　　�、谀さ奶幚恚河�2×SSC ，濕潤(rùn)均勻，37℃烘干后，即可點(diǎn)樣

　　　�、埸c(diǎn)樣：取變性待檢核酸1ul 點(diǎn)在硝酸纖維素膜（0.45um）上，同 時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照，室溫干燥。

　　　�、�80℃真空干燥2h，將DNA固定于膜上。

　　　　2. 預(yù)雜交及雜交

　　　�、兕A(yù)雜交：將雜交膜放入裝有適當(dāng)體積預(yù)熱的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)雜交液的雜交 袋或雜交杯中 ，37℃預(yù)雜交 30分鐘，輕輕攪拌使膜在該溫度下孵育。

　　　�、趯�DIG標(biāo)記的DNA探針置沸水浴5min后，迅速用冰水冷卻以變 性DNA探針。

　　　�、蹖⒆冃缘腄IG標(biāo)記DNA探針加入到預(yù)熱的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)雜交液(2.5ml／ cm2)中并充分混勻。

　　　�、軐㈦s交膜放到含DIG標(biāo)記探針的雜交液中。輕輕攪拌，在68℃ 孵育至少6h（對(duì)于檢測(cè)微量DNA中的單拷貝基因則需孵育16h）。

　　　�、蓦s交后洗滌：用足夠量的2×SSC，0.1%SDS室溫漂洗2次，每次5min；用0.1×SSC，0.1%SDS 68℃漂洗2次，每次15min，漂洗過程中需不斷輕輕攪拌。

　　　　（三）免疫學(xué)檢測(cè)

　　　【材料】

　　　　1. 馬來酸緩沖液（0.1M馬來酸，0.15M Nacl。pH7.5）

　　　　2. 洗液（馬來酸緩沖液加入0.3％吐溫20(v/v)）

　　　　3. 阻斷液（10×濃縮的阻斷液經(jīng)馬來酸緩沖液10倍稀釋，新鮮配制）

　　　　4. 檢測(cè)液（lM Tri s-HCl，0.1MNaCl，50mM Mgcl2，pH9.5（20℃預(yù)熱）

　　　　5. 顯色基底液（加200ul NBT/BCIP濃縮液到10ml檢測(cè)液中，新鮮配制）

　　　【方法】

　　　　1. 將經(jīng)過雜交和嚴(yán)格清洗后的膜用馬來酸緩沖液漂洗1~5min；將膜在l00ul阻斷液中孵育30min。 　　

　　　　2. 用阻斷液稀釋抗D1G抗體至適宜濃度(1：5000左右)。

　　　　3. 傾出封閉液，將膜在20ml抗DIG抗體溶液中孵育膜30min；馬來酸緩沖液洗膜2次，每次15min，再用2m1檢測(cè)液平衡膜2~5min。

　　　　4. 將雜交膜在現(xiàn)配制的顯色基底液中孵育，并用塑料袋或盒在暗室中密閉保存（顯色過程中不能搖動(dòng)）。

　　　　5. 幾分鐘內(nèi)可有顏色沉淀形成（16h完成反應(yīng)，反應(yīng)過程中可短暫暴露于陽光下以觀察反應(yīng)進(jìn)展）。

　　　　6. 當(dāng)顏色斑點(diǎn)（或條帶）達(dá)到一定強(qiáng)度后，可用50ml去離子水或TE溶液洗膜5min以中止反應(yīng)。 　　

　　　　7. 顯色后的濾膜可封存于聚乙烯袋內(nèi)或拍照片保存。