反應(yīng)條件對雜交的影響

    自1975年Southern發(fā)明Southern雜交方法以來，人們又發(fā)展了許多方法可以使溶液中的放射性探針與固定在濾膜上的核酸雜交，這些方法在原理上都基本相同，所不同之處只是反應(yīng)條件。反應(yīng)條件有如下主要區(qū)別。

    1．所用的雜交溶劑和溫度不同，如水溶液中68℃，50％甲酰胺溶液中42℃。

    2．溶劑的體積和雜交時間的長短不同對較大的體積雜交時間可長達3d，而較小的體積雜交時間則短至4h。

    3．雜交過程中攪動的方法和程度不同可分連續(xù)振蕩或靜止。

    4．用不同的試劑(如Denhardt^,s試劑或一種由5％脫脂奶粉組成的Blotto)作為封閉劑，以阻止探針非特異性地附著在固相載體表面。

    5．標記探針的濃度及其比活性不同。

    6．是否用其他化合物，如硫酸葡聚糖或PEG，以提高核酸重新結(jié)合的能力。

    7．雜交的清洗是否嚴格。

    (二)影響雜交的因素

    以上這些條件的改變，對雜交有不同的影響，應(yīng)根據(jù)實驗的具體情況，選用適當?shù)姆椒ā，F(xiàn)將各種因素對雜交的影響介紹如下。

    1．在50％甲酰胺、42℃條件下的雜交反應(yīng)與在水溶液中、68℃下進行的反應(yīng)相比，前者對硝酸纖維素濾膜更溫和，但它的雜交速度比水溶液中約慢2—3倍。通常兩種溶液都能獲得良好的結(jié)果，彼此也無明顯的優(yōu)劣之分。

    2．雜交溶劑的體積越小越好，在小體積溶液中,核酸重新配對的速度更快，探針的用量也少，從而使濾膜的DNA在反應(yīng)中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的溶液使濾膜始終被覆蓋。

    3．連續(xù)振蕩探針溶液是為了在用數(shù)張濾膜進行雜交時防止相互粘連，一般情況下不需要連續(xù)振蕩。

    4．許多試劑可阻止探針與濾膜表面的非特異性吸附，它們包括Denhardt，s試劑、肝素和脫脂奶粉。這些試劑一般與變性斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA和SDS一起配合作用。對低度mRNA的Nothorn雜交或哺乳動物DNA單拷貝序列的Southern雜交，一般用5XDenhardt，s試劑、0．5％SDS和100／1g／m1變性斷裂的DNA組成的封閉劑預(yù)雜交濾膜。但在大多數(shù)情況下，可使用0．5％脫脂奶粉。與Denhardt’s試劑相比，脫脂奶粉更便宜，使用也方便，并可獲得同樣滿意的結(jié)果。但它不能用于RNA雜交，因為脫脂奶粉中含有較高的RNA酶活性。一般而言，對尼龍膜用Denhardt’s試劑比用脫脂奶粉能得到更高的信噪比。

    5．雜交時間  對雙鏈探針掌握下述粗略的估計方法并控制雜交反應(yīng)時間，可保證溶液中的探針達到1～3Cot_1/2。

    在10ml雜交液中，如g 5kb長的探針在2h內(nèi)可達到Cot_1/2，對其他任何探針可用下列方程式：

(1/x)×(y/5)×(z／10)×2＝達到Cob_1/2的小時數(shù)

    式中：x=所加探針量(ug)，y＝探針的長度(kb)，z=反應(yīng)體積(m1)。

    雜交達到3XCot_1/2后，對能繼續(xù)進行雜交的探針即可忽略不計。對于單鏈探針，雜交時間還可縮短，因為在溶液中無競爭反應(yīng)，有利于探針與固定在濾膜上的DNA雜交。

    6．對硝酸纖維素濾膜，通常在預(yù)雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜，經(jīng)常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質(zhì)會干擾探針和目的基因退火。當使用的探針或寡核苷酸長度低于100個核苷酸時，雜交信號的掩蓋作用特別明顯。

    7．加入10％硫酸葡聚糖或10％PEG，雜交速度可增加約10倍。這對檢測稀有序列很有用，但對篩選細菌或噬菌斑卻無效。此外，它們有時會導致本底較高，并由于它們的黏稠性而使雜交溶液難以操作。因此，除雜交速度非常慢，濾膜上含有的DNA量很少，或放射性探針的量有限之外，不要用硫酸葡聚糖或PEG。

    8．在水溶液中雜交時，用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一樣，但在甲酰胺溶液，中雜交時，應(yīng)該用6×SSPE，因為它具有更強的緩沖能力。

    9。一般而言，洗滌條件應(yīng)盡可能嚴格，通常在低于雜交體解鏈溫度(melting ternperature，Tm)即12—20℃的條件下進行。

    10．為了降低本底，應(yīng)盡量少用探針，并在最短時間內(nèi)完成雜交反應(yīng)。