原位雜交實驗要求及步驟

原位雜交組織(或細胞)化學 (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 簡稱原位雜交(In Situ Hybridization)，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應直接顯示。間接法一般用半抗原標記探針，最后通過免疫組織化學法對半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。原位雜交最初是以同位素標記探針進行的。盡管同位素標記(如35S，3H，32P等)仍然廣泛使用，但非同位素標記探針的迅速發(fā)展(尤其是生物素標記探針和地高辛標記探針)，更引起科技工作者的極大興趣。

一、基本要求

組織取材：組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細胞最好在30min內(nèi)固定。
固定：目的是(1)保持細胞結(jié)構(gòu)；(2)最大限度地保持細胞內(nèi)DNA或RNA的水平；(3)使探針易于進入細胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑(如戊二醛)不同，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。
增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：(1)稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結(jié)合，以降低背景，雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10min，經(jīng)乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團通過乙酰化而被阻斷。組織和細胞標本亦可用0.2M HCl處理10min，稀酸能使堿性蛋白變性，結(jié)合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。(2)去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進入組織細胞，最常應用的去污劑是Triton X-100。注意：過度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還會引起靶核酸的丟失。(3) 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K)，還有鏈霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。
雜交緩沖液孵育：雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2hr，以阻斷玻片和標本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點，達到減低背景的目的。
防止污染：由于在手指皮膚及實驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結(jié)果，在整個雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤(180℃)以達到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時所用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。
雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：雜交反應進行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進行雜交(包括檢測RNA時)，雙鏈DNA探針
在雜交前必須進行變性。探針變性后要立即進行雜交反應，不然解鏈的探針又會重新復性。
雜交液：雜交液內(nèi)除含一定濃度的標記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA:RNA，RNA:DNA，DNA:DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。所以，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達到提高雜交率的目的(尤其對雙鏈核酸探針)。在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，以減低背景。
探針的濃度：探針濃度依其種類和實驗要求略有不同，一般為0.5-5.0μg/ml(0.5-5.0ng/μl)。最適宜的探針濃度要通過實驗才能確定。
探針的長度：一般應在50-300個堿基之間，最長不宜超過400個堿基。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。

二、試劑準備

1． 0.1M PBS (pH7.2)：Na2HPO4•12 H2O 61.6g、NaH2PO4•2 H2O 5.6g、NaCl 9g，加ddH2O至2000ml，高壓滅菌。
2． 0.2M PB ((pH7.2)：Na2HPO4•12 H2O 61.6g、NaH2PO4•2 H2O 5.6g 加ddH2O至1000ml，高壓滅菌。
3． 0.1M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1M PBS，定容至100ml，高壓滅菌。
4． 4%多聚甲醛：多聚甲醛40g加ddH2O 400ml，加熱至70℃左右，用1M NaOH調(diào)pH至7.0，用ddH2O定容至500ml，再加0.2M PB 500ml，總體積為1000ml。
5． 16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4g、小牛血清白蛋白（BSA） 0.4g、聚蔗糖0.4g，加dd H2O至10ml，無菌抽濾、分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?BR>6． 預雜交液：去離子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2ml、1M Tris-HCl(pH 8.0) 0.2ml、5M NaCl 1.2ml、0.5M EDTA(pH 8.0) 0.04ml、0.1M二硫蘇糖醇 2 ml、ddH2O 2.21ml，總體積為10ml。無菌抽濾、分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前加入50mg/ml變性鮭魚精DNA 75μl/ml。
7． 20×SSC: NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加水至800ml，用2N NaOH調(diào)pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。
8． 抗體稀釋液：Triton X-100 80μl、BSA 0.2g，以0.05M PBS定容至20ml。
9． TSM1：1M Tris-HCl(pH 8.0)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml，加ddH2O 100ml。
TSM2（新鮮配制）：1M Tris-HCl(pH 9.5)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml，加ddH2O至100ml。
顯色液（臨用前現(xiàn)配）：5ml TSM2 加顯色液原液（NBT/BCIP）150μl，并加適量左旋咪唑使其終濃度為0.24μg/ml，避光。

三、操作步驟

（一）取材、冰凍切片：
將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交專用玻片上，切片厚度為15-20μm。

（二）探針制備與檢測（定量）：
1．隨機引物制備cDNA核酸探針
以DIG DNA 標記檢測試劑盒為例：
（1）探針制備：
①模板DNA(0.5-3μg) 15μl，100℃變性10min，冰浴5 min。
②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2μl, dNTPmix 2μl, Klenow Enzyme 1μl，反應總體積為20μl。37℃孵育過夜。
③在上述20μl的標記產(chǎn)物中加4M LiCl 2.5μl, 75μl（無水乙醇預冷）,輕輕混勻，-20℃放置 2hr。4℃離心12000g×15min，棄上清。70%乙醇(預冷) 50μl洗滌，7500g×5min，棄上清，晾干沉淀,加TE 50μl溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?BR>（2）探針敏感性檢測：
①樣品稀釋：取dig-標記探針1μl 用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀釋。
②取一張與點樣器大小相近的尼龍膜，標記方向，ddH2O中浸泡 1min，6×SSC中浸泡10min，置點樣器上，負壓抽吸5min。
③將上述樣品點于尼龍膜上，繼續(xù)抽吸10min。
④取下尼龍膜，置紫外燈下10cm處照射5min，晾干。
⑤將膜置于適量預雜交液（5-10 ml）中，37℃預雜交10min。
⑥加入Anti-dig 抗體（1:5000），37℃雜交30min。
⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。
⑧顯色：15 mlTSM2中加300μl顯色液（NBT/BCIP），37℃避光顯色30min。

1． PCR法制備cDNA核酸探針：
（１） 探針制備：
以PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例：
在0.5ml離心管中，依次加入：
PCR 引物 1（10pM） 2μl
PCR 引物 1（10pM） 2μl
質(zhì)粒DNA 模板（10-100pg） 2μl
PCR DIG mix 2μl
(含dNTP和DIG-11-dUTP)
dNTPmix 2μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
加入適量ddH2O，使總體積達50μl。
① 將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 45s → 58℃ 45s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃ 保溫7min。
② 在上述PCR產(chǎn)物中加入4M LiCl 12.5μl、預冷無水乙醇375μl，輕輕混合后置于-20℃2hr, 12,000g×15min，棄上清。70%乙醇(預冷) 120μl洗滌沉淀，離心7500g×5min，棄上清，晾干沉淀,加TE 50μl溶解,-20℃保存?zhèn)溆谩?BR>（2）探針檢測：
行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量（采用目測法）。

（三）原位雜交反應（以DIG-cDNA探針為例）：
1．0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
2．0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
3．0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
4．0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。
5． 4%多聚甲醛浸5min。
6． 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
7．預雜交：滴加適量預雜交液，42℃ 30 min。
1． 雜交：傾去預雜交液，在每張切片上滴加10-20μl雜交液（將探針變性后稀釋在預雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟膜，42℃ 過夜。（陰性對照
2． 洗片：
(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；
0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC與0.1M PBS各半洗10min；
0.05M PBS 洗 5min×2次。
10．3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.
11． 滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復合物（以抗體稀釋液1:5000稀
釋）4℃孵育過夜。
12． 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鮮配制TSM2 10min×2次。
13． 顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過夜。
14． 將玻片置于TE中10-30min以終止反應。酒精梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹膠封片。
15．顯微鏡下觀察結(jié)果。