毛細管電泳的應(yīng)用前景

一, 毛細管電泳的興起與發(fā)展

    毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE),又稱高效毛細管電泳(HPCE)是近年來發(fā)展最快的分析化學(xué)研究領(lǐng)域之一.1981年Jorgenson等[1]在75μm內(nèi)徑的毛細管內(nèi)用高電壓進行分離,創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細管電泳.1984年Terabe等[2]發(fā)展了毛細管膠束電動色譜(MECC).1987年比Hjerten[3]建立了毛細管等電聚焦(CIEF),Cohen和Karger[4]提出了毛細管凝膠電泳(CGF).1988—1989年出現(xiàn)了第一批CE商品儀器,1989年第一屆國際毛細管電泳會議召開,標(biāo)志了一門新的分支學(xué)科的產(chǎn)生.短短的幾年內(nèi),由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學(xué)各領(lǐng)域中對生物大分子(肽,蛋白,DNA等)的高度分離分析的要求,得到了迅速發(fā)展,正逐步成為生命科學(xué)及其它學(xué)科實驗室中一種常用的分析手段.近三年來國際毛細管電泳會議與會者均達700—800人,1996,1997兩年公開發(fā)表的有關(guān)CE論文達3600余篇.可參見相關(guān)綜述則[5-8].歐洲,美國國內(nèi)及日本也相繼召開CE地區(qū)性國際會議.我國在CE領(lǐng)域研究起步早,發(fā)展快,研究工作較全面,有的研究成果達到國際先進水平.定期召開全國CE會議及亞太地區(qū)國際會議,在國際上已有一定的影響.1984年中國科學(xué)院化學(xué)所竺安教授在國內(nèi)率先開展CE研究,迄今國內(nèi)已有幾百個單位開展CE研究和應(yīng)用.從CE理論到各種模式及各方面應(yīng)用,國內(nèi)均在進行.1998年舉行的第三屆全國CE會議共收錄論文129篇,同時舉行的第二屆亞太國際會議也取得了成功.毛細管電色譜(CEC),CE/MS聯(lián)用,低背景毛細管梯度凝膠電泳,手性藥物分離,逆流聚焦及脫氧核糖核酸(DNA)各種CE測定方法等一批研究成果均達到國際先進水平.

二, 毛細管電泳基本原理

    CE是以高壓電場為驅(qū)動力.以毛細管為分離通道,依據(jù)樣品中各組成之間淌度和分配行為上的差異,而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù).儀器裝置包括高壓電源,毛細管,柱上檢測器和供毛細管兩端插入又和電源相連的兩個緩沖液貯瓶,在電解質(zhì)溶液中,帶電粒子在電場作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱電泳.CE所用的石英毛細管在PH>3時,其內(nèi)液面帶負電,和溶液接觸形成一雙電層.在高電壓作用下,雙電層中的水合陽離子層引起溶液在毛細管內(nèi)整體向負極流動,形成電滲液.帶電粒子在毛細管內(nèi)電解質(zhì)溶液中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)二者的矢量和.帶正電荷粒子最先流出;中性粒子的電泳速度為"零",故其遷移速度相當(dāng)于EOF速度;帶負電荷粒子運動方向與EOF方向相反,因EOF速度一般大于電泳速度,故它將在中性粒子之后流出;各種粒子因遷移速度不同而實現(xiàn)分離,這就是毛細管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)的分離原理.CZE的遷移時間t可用下式表示:
式中,μep為電泳淌度,μen為電滲淌度,V為外加電壓,ιt為毛細管總長度,ιd為進樣到檢測器間毛紉管長度.理論塔板數(shù)N為:
式中,D為擴散系數(shù).分離度R為<BR>式中,μ1,μ2分別為二溶質(zhì)的電泳淌度,μep為二溶質(zhì)的平均電泳淌度.
從式(11.2)可看出,CE的N是和溶質(zhì)的擴散系數(shù)D成反比,而高效液相色譜 (HPLC)的N和D成正比,因此擴散系數(shù)小的生物大分子,CE的柱效比HPLC高得多.CE比HPLC有更高的分離能力,主要由兩個因素決定:一是CE在進樣端和檢測時均沒有像HP比的死體積;二是CE用電滲流作推動流體前進的驅(qū)動力,整個流體呈扁平型的塞式流,使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細管內(nèi)不易擴散,而HPLC用壓力驅(qū)動使柱中流體呈拋物線型,導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶擴散,使校效下降
    CE將經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離有機地結(jié)合,取得了比HPLC和平板凝膠電泳更多的優(yōu)點.概括起來可謂三高二少一廣.高質(zhì)量靈敏度:常用紫外檢測器檢測限可達10-13一10-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測器(LIF)則達10-19一10-21mol.高分辨率:每米理論塔板數(shù)為幾十萬,高者可達幾百萬乃至幾千萬.高速度:許多分析可在幾十秒內(nèi)完成.所需樣品少:只需納升(10-9)的進樣量.成本低:只需少量的流動相和低廉的毛細管.應(yīng)用范圍廣;除分離生物大分子外,還可用于小分了(氨基酸,藥物等)及離子(無機及有機離子).甚至可分離各種顆粒(如細胞,硅膠顆粒等).
    CE發(fā)展迅速也得力于大批色譜工作者轉(zhuǎn)向CE,在理論上提出了各種模型,如解釋CZE中區(qū)帶擴展及理論塔板高度模型,熱影響模型,遷移速率和分離度模型等等[9-10].近年來基礎(chǔ)研究集中于解決CE應(yīng)用中一些關(guān)鍵性問題.如EOF對分離,定量影響極大,故研究了測弱EOF的方法,陽離于存在下的EOF,還有在兩個中性標(biāo)記物之間夾一個緩沖液塞的三明治式方法測定EOF [11].EOF測定將解決CE定量問題.電泳淌度定量計算也在發(fā)展,如用金屬陽離子的一些結(jié)構(gòu)參數(shù),定量得出結(jié)構(gòu)—保留(電泳)間的關(guān)系(QSRR) [12]及計算手性化合物淌度的軟件等.特別是各種優(yōu)化方法用于優(yōu)化CZE,MECC,CEC及手性分離的實驗參數(shù),如重疊分離譜(OBM),多變量統(tǒng)計設(shè)計及Plackett-Buman多變量實驗設(shè)計[13]等.

三, 毛細管電泳分離模式

    按毛細管內(nèi)分離介質(zhì)和分離原理的不同,CE現(xiàn)有六種分離模式,分述如后.
1. 毛細管區(qū)帶電泳(CZE)
    CZE分離機理是基于各被分離物質(zhì)的凈電荷與其質(zhì)量比(荷質(zhì)比)間的差異.迄今CZE仍是應(yīng)用最多的模式,應(yīng)用范圍包括氨基酸,肽,蛋白,離子,對映體拆分和很多其它帶電物質(zhì)的分離.CZE常用介質(zhì)為電解質(zhì)水溶液,根據(jù)情況可加入不同有機溶劑或其它添加劑.還有一種非水CE,如在乙腈中加入嗡 鹽(tropyltum)來分離多環(huán)芳烴化合物,現(xiàn)在發(fā)展到可不加支持電解質(zhì),直接用乙腈,甲酰胺,甲醇等作溶劑來進行非水CE[14].
毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)
    CGE是將平板電泳的凝膠移到毛細管中作支持物進行電泳,不同體積的溶質(zhì)分子在起"分子篩"作用的凝膠中得以分離.常用于蛋白質(zhì),寡聚核苷酸,核糖核酸(RNA),DNA片段分離和測序及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物分析.CGE能達到CE中最高的柱效.為了解決人類基因組計劃的關(guān)鍵,即DNA測序的速度,已試制出96支毛細管陣列的DNA測序儀,并已有8支毛細管陣列的DNA測序商品儀器.凝膠的制備和不同模式令人關(guān)注,最近發(fā)展出—種低背景毛細管梯度凝膠電泳[15],在測定糖,寡聚核苷酸及人工模擬蛋白方面取得進展.還有報道采用親和凝膠電泳來識別和鑒定基于DNA藥物的結(jié)合蛋白等.
3. 毛細管膠束電動色譜(mfcellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)
    采用表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉,SDS)在運動緩沖液內(nèi)形成一疏水內(nèi)核,外部帶負電的動態(tài)膠束相,利用溶質(zhì)具有不同的疏水性,因而在水相和膠束相(準(zhǔn)面定相)間分配的差異進行分離,既能分離中性溶質(zhì)又能分離帶電組分的CE模式.MECC拓寬了CE的應(yīng)用范圍,主要用于小分子,中性化合物,手性對映體和藥物等.常用表面活性劑有各種陰離子表面活性刑,陽離子表面活性劑,非離子和兩性表面活性劑.也有用混合膠束,如陰離子表面活性劑和膽酸鹽組合混合膠束.有報道采用脂肪醇的微乳液膠束電動色譜(MEEKC)有比MECC更高的柱效,更快的分析速度和容易控制"窗口" [16].我們也成功地用MEEKC同時分離測定酸性和堿性蛋白.
4. 毛細管等電聚焦(capillary isoelelectric focusing,CIEF)<BR>用兩性電解質(zhì)在毛細管內(nèi)建立pH梯度,使各種具有不    同等電點的蛋白質(zhì)在電場作
用下遷移到等電點的位置,形成窄的聚焦區(qū)帶.已成功地用于測定蛋白質(zhì)等電點,分離<BR>異構(gòu)體等.如用CZE和CIEF研究制備過程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性,<BR>結(jié)果表明CIEF方法要比CZE的好[17].
5. 毛細管等速電泳(capillary isotachophoresis,CTTP)<BR>采用先導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì).使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得    以分離,是一種較老的方式.現(xiàn)在常用作柱前濃縮方法用以富集樣品,以解決CE測定中濃度靈敏度不如服比的問題,如HPLC的問題,如在線ITP—CZE即是成功的模式[18].
6. 毛細管電色譜(capillary electrochromatography,CEC)
    將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細管中(或涂漬到管壁).以樣品與固定相之間的相互作用為分離機制,以電滲流為流動相驅(qū)動力的色譜過程稱為CEC[19-20]. CEC將CE的高效和HPLC的高選擇性相結(jié)合,得到了CE研究者的青睞.90年代初解決了毛細管填充技術(shù)后,CEC發(fā)展迅速,HPCE'97會議上已達35篇論文,HPCE'98又創(chuàng)54篇之多.CEC可分為開管CEC(即管壁涂漬固定相)和填充CEC.我國學(xué)者在CEC方面作了大量研究工作,對CEC的理論,反相電色譜,正相電色譜,離子交換電色譜及電色譜手性分離等模式均作了較系統(tǒng)研究[21-23],連續(xù)兩年在國際CE會上作大會報告,目前已在ODS,硅膠,氰基,胺基,陰,陽離子交換樹脂等10余種填料CEC柱上進行研究,開管CEC也發(fā)展了一些新技術(shù),如硅膠—溶膠法在管壁涂漬C8固定相[24],分子印刷法分離手性化合物[25].
    以上六種模式為CE基本模式,此外如親和,免疫毛細管電泳發(fā)展趨勢亦較好.

四,毛細管電泳柱技術(shù)

    毛細管是CE的核心部件之一.早期研究集中在毛細管直徑,長度,形狀和材料方面,目前集中在管壁的改性和各種柱的制備.
1. 動態(tài)修飾毛細管內(nèi)壁
    管壁改性主要是消除吸附和控制電滲流,通常采用動態(tài)修飾和表面涂層兩類方法.動態(tài)修飾采用在運行緩沖液中加入添加劑,如加入陽離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB),能在內(nèi)壁形成物理吸附層,使EOF反向.添加劑還有聚胺,聚乙烯亞胺(PEI)等,甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層.
2. 毛細管內(nèi)壁表面涂層
    涂層方法有很多種,包括物理涂布,化學(xué)鍵合及交聯(lián)等 最常用的方法是采用雙官能團的偶聯(lián)劑,如各種有機硅烷,第一個官能團(如甲氧基)與管壁上的游離羥基進行反應(yīng),使其與管壁進行共價結(jié)合,再用第二個官能團(如乙烯基)與涂漬物(如聚丙烯酰胺)進行反應(yīng),形成一穩(wěn)定的涂層.此外還有將纖維素,PEI和聚醚組成多層涂層,親水性的絨毛涂層(fuzzy)和聯(lián)鎖聚醚涂層[6].
3. 凝膠柱和無膠篩分
   CGE的關(guān)鍵是毛細管凝膠柱的制備,常用聚丙烯酰胺凝膠栓來進行DNA片段分析和測序.測定蛋白質(zhì)和肽的分子量常用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-LPAGE).如將聚丙烯配胺單體溶液中的交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)濃度降為零,得到線性非交聯(lián)的親水性聚合物用作操作溶液,仍有按分子大小分離的作用,稱無膠篩分.此法簡單,使用方便,分離能力比CGE差.
4. 毛細曾填充往等
    CEC填充柱已在前面論述.也有將核糖核酸酶,己糖激酶,腺苷脫氨酶等固定到
毛細管表面,構(gòu)成一開管反應(yīng)器,再和CE連接,可進行核酸選擇性檢測,微量在線合成和分離寡核昔酸等工作.另一有意義的工作是用各種方式在毛細管內(nèi)緩沖液中形成各種梯度,如PH梯度,溶劑濃度梯度等,來提高分離效率和選擇性.

五, 毛細管電泳檢測技術(shù)

     CE對檢測器靈敏度要求相當(dāng)高,故檢測是CE中的關(guān)鍵問題.迄今為止除了原子吸收光譜與紅外光譜末用于CE外,其它檢測手段均已用于CE.現(xiàn)選擇重要的幾類檢測器介紹其最新進展.
1. 紫外檢測器(UV)
    UV檢測器集中在提高靈敏度,如采用平面積分檢測池,這種設(shè)計可使檢測光路增加到1cm[26].也有用光散射二極管(LEDS)作光源,其線性范圍和信噪比優(yōu)于汞燈.總體來說進展不大.
2. 激光誘導(dǎo)熒光檢測[LIF]
    LIF是CE最靈敏的檢測器之一,極大地拓展了CE的應(yīng)用,DNA測序就須用LIF,單細胞和單分子檢測也離不開LIF.LIF不但提高了靈敏度,也可增加選擇性,缺點在于被測物須用熒光試劑標(biāo)記成染色.利用CE-LIF技術(shù)可檢出染色的單個DNA分子,向癌癥的早期診斷及臨床酶和免疫學(xué)檢測等方向進行.CE/LIF向三個方向發(fā)展:在原有氦—鎘激光器(325nm)和氬離子激光器(488nm)之外,發(fā)展價廉,長波長的二極管激光器;發(fā)展更多的熒光標(biāo)記試劑來擴展應(yīng)用面;開展更多的應(yīng)用研究.CE/I'IF和微透析結(jié)合可測定腦中神經(jīng)肽.采用波長分辨熒光檢測器可提供有關(guān)蛋白和DNA序列的一些結(jié)構(gòu)和動態(tài)信息[27].一些適用于二極管激光器的熒光標(biāo)記試劑如CY—5等,正在不斷開發(fā)和應(yīng)用.
3. CE/MS聯(lián)用
    將現(xiàn)在最有力的分離手段CE和能提供組分結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜聯(lián)用,彌補了CE定性鑒定的不足,故發(fā)展特別快.CE/MS聯(lián)用主要在兩方面發(fā)展:一是各種CE模式和MS聯(lián)用,二是CE和各種MS聯(lián)用.關(guān)鍵是解決接口裝置.成功地應(yīng)用到CE/MS接口中.