ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析簡介

　 隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用 , 使體外檢測各種細(xì)胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）檢測體液中游離的細(xì)胞因子（ CK ）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及 CK 的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ ELISPOT ）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

　　ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，應(yīng)用德國AID的ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)可以對斑點(diǎn)進(jìn)行分析得出結(jié)果。

幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能使結(jié)果更有意義？

ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當(dāng)?shù)目乖�刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養(yǎng)一段時間。一般而言，記憶型T細(xì)胞在受抗原刺激數(shù)小時后會開始分泌細(xì)胞激素，此時局部(在緊靠分泌細(xì)胞的周圍)分泌出的細(xì)胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細(xì)胞被移除并清洗后，被捕獲的細(xì)胞激素可進(jìn)一步使用生物素（Biotin）標(biāo)記的二次抗體來標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會留下約10-20mm大小染色的斑點(diǎn)。

ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky 等人率先在1983年，運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率。從那時起世界各國免疫學(xué)者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競賽，每個團(tuán)隊(duì)都希望能率先將此一技術(shù)推廣來研究T細(xì)胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，藉由偵測T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子，來定量機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預(yù)測體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進(jìn)行的下游免疫反應(yīng)。
　　ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說操作簡單，但該技術(shù)并沒能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細(xì)胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細(xì)胞免疫走向T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生的第一個主要問題，便是靈敏度的提升，因?yàn)?FONT face="Times New Roman">T細(xì)胞因子較之B細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術(shù)性的問題，使當(dāng)時多數(shù)研究團(tuán)隊(duì)很難獲得清晰的斑點(diǎn)，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn)PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點(diǎn)呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子能在細(xì)胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點(diǎn)集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜（Panel B）并行實(shí)驗(yàn)的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過完全相同的實(shí)驗(yàn)，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點(diǎn)。

　

第二個技術(shù)性問題是ELISPOT Cytokine實(shí)驗(yàn)分析的幾個基本假設(shè)缺乏科學(xué)實(shí)證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問題，諸如； 　　

·  實(shí)驗(yàn)所得的斑點(diǎn)是抗原特定T細(xì)胞所生產(chǎn)，還是旁觀細(xì)胞受Cytokine刺激的次級效應(yīng)？

·  斑點(diǎn)的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？

 

·  能否相信斑點(diǎn)是由單一的細(xì)胞造成？ · ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測量的頻率范圍？ · 如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時產(chǎn)生，它們是否會互相妨礙？及到什么程度？

·  移植研究 – allograft rejection

·  疫苗開發(fā) -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響

·  Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析

·  自體免疫研究 – 免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究

·  癌癥研究 -腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞作用

·  過敏機(jī)制探討 – IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機(jī)制之細(xì)胞激素研究

·  傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等

·  抗原決定位定圖

·  體液免疫力研究 – B細(xì)胞免疫球蛋白及特定亞型反應(yīng)的進(jìn)展研究

圖注：ELISPOT 法在檢測低頻率產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞時具有獨(dú)一無二的敏感性。將指定數(shù)目的能產(chǎn)生 IFN- 的T細(xì)胞與一百萬個抗原呈現(xiàn)細(xì)胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和 ELISA 法（下圖）分別測量產(chǎn)生 IFN- 的細(xì)胞的數(shù)目。 ELISPOT 分析使單細(xì)胞分泌產(chǎn)物可視化。這些分析異常敏感，因?yàn)樗�是在直接在分泌�?xì)胞的周圍進(jìn)行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細(xì)胞上的受體捕獲，或降解之前。

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