PCR Array 簡(jiǎn)單實(shí)用的檢測(cè)基因表達(dá)的高通量方法

H1-H5孔包含了5個(gè)看家基因（HK1-HK5），用于芯片數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。H6為基因組DNA參照（GDC），其中固定的引物能特異性的檢測(cè)非轉(zhuǎn)錄的基因組DNA重復(fù)片段，從而檢測(cè)樣品中是否存在DNA污染。H7到H9是三個(gè)重復(fù)的孔，均為反轉(zhuǎn)錄參照（RTC），用于檢測(cè)RT反應(yīng)的效率。H10到H12是陽(yáng)性PCR參照（PPC），反映了PCR反應(yīng)的效率。這些孔中加入了人工合成的DNA序列和相應(yīng)的引物對(duì)。兩組重復(fù)的對(duì)照RTC和PPC也可以用于檢測(cè)芯片間和芯片內(nèi)的一致性。 

96孔模式的RT²Profiler PCR芯片根據(jù)SuperArray的Pathway-Centric ^TM原理設(shè)計(jì)，將現(xiàn)有的重要信號(hào)通路研究進(jìn)展與PCR芯片方法結(jié)合，是檢測(cè)信號(hào)通路提供獨(dú)特的研究工具。在設(shè)計(jì)PCR芯片時(shí)，Superarray公司綜合了文獻(xiàn)資料，數(shù)據(jù)庫(kù)信息，專家意見和用戶反饋，不斷根據(jù)客戶需要開發(fā)新產(chǎn)品，并使芯片中所包含的基因更完整，更精確。在目前的市場(chǎng)中，SuperArray所提供的信號(hào)通路范圍最廣，并且有針對(duì)人，小鼠和大鼠的PCR 芯片產(chǎn)品（參見表1以及產(chǎn)品目錄）。在芯片設(shè)計(jì)中，還整合了預(yù)測(cè)資料和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，幫助研究者系統(tǒng)地有針對(duì)性的開展研究。這些預(yù)設(shè)計(jì)的PCR芯片，分類詳細(xì)，針對(duì)性強(qiáng)，使研究者無(wú)需自己一一挑選基因，節(jié)省大量時(shí)間和精力，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)便快速，大大推進(jìn)了生命科學(xué)研究進(jìn)展。目前，預(yù)設(shè)計(jì)的PCR芯片涵蓋了細(xì)胞凋亡，炎癥反應(yīng)，信號(hào)傳導(dǎo)，癌癥以及其他疾病等廣泛的生物學(xué)通路和疾病。詳細(xì)的芯片列表請(qǐng)登陸公司網(wǎng)站查詢。

應(yīng)用范圍	PCR芯片產(chǎn)品舉例	芯片所包含的部分基因
生物學(xué)途徑	人細(xì)胞凋亡 （Cat. No. APHS-012）	TNF 配體和受體   BCL2 家族成員 Caspases         死亡效應(yīng)功能域 ATM和p53信號(hào)通路
功能或者結(jié)構(gòu)相關(guān)基因	小鼠細(xì)胞因子 （Cat. No. APMM-021）	干擾素和白介素    骨形態(tài)發(fā)生蛋白 腫瘤壞死因子      多種生長(zhǎng)因子
信號(hào)傳導(dǎo)途徑	人NFKB信號(hào)通路 （Cat. No. APHS-025）	細(xì)胞外配體和受體  NFκB和IκB 家族成員 激酶 轉(zhuǎn)錄因子 反應(yīng)基因
疾病相關(guān)	人癌癥信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)者 （Cat. No. APHS-033）	細(xì)胞周期控制和DNA損傷修復(fù) 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老 細(xì)胞黏附 血管生成 浸潤(rùn)和腫瘤轉(zhuǎn)移

表1 SuperArray 提供的PCR Array產(chǎn)品舉例

 

如果現(xiàn)有的產(chǎn)品無(wú)法滿足研究者的特定需要，SuperArray還可以提供從設(shè)計(jì)到芯片生產(chǎn)的完整服務(wù)，為研究者提供使用先進(jìn)的PCR芯片的便捷服務(wù)�？蛻粲喼菩酒�服務(wù)為研究者提供以下便利：1）在使用表達(dá)譜基因組芯片后，對(duì)從基因組水平篩選出來(lái)的一組基因進(jìn)行驗(yàn)證；2）在現(xiàn)有產(chǎn)品的基礎(chǔ)上作適當(dāng)調(diào)整以適應(yīng)特殊需要；3）完全從頭設(shè)計(jì)，適用于在現(xiàn)有的預(yù)設(shè)計(jì)PCR芯片中尚未包括的某個(gè)信號(hào)通路或者一組基因。若研究基因數(shù)目少于84個(gè)，還可以將96孔PCR芯片進(jìn)一步分成更小的形式，從而可以在一次PCR反應(yīng)中研究多個(gè)樣品。或者進(jìn)行多次重復(fù)。

有了這些產(chǎn)品和服務(wù)，研究者在利用這項(xiàng)新技術(shù)時(shí)，可以專注于研究自己所感興趣的特定基因組合時(shí)，實(shí)驗(yàn)中也更加省時(shí)省力。

   完整的PCR芯片實(shí)驗(yàn)體系包括RT²Profiler^TM PCR芯片，RT² Real-Time^TM SYBR Green PCR反應(yīng)體系和cDNA合成試劑盒。所有這些組分均為基于SYBR Green的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)優(yōu)化。精心設(shè)計(jì)的引物和優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系一起，為PCR芯片的特異性提供保證。在反應(yīng)體系中還加入了指示染料，用于檢測(cè)PCR反應(yīng)平臺(tái)的可靠性。

采用PCR芯片開展研究，技術(shù)上的難點(diǎn)是如何在同一次實(shí)驗(yàn)中，相同的PCR反應(yīng)條件下保證不同的基因有相近的擴(kuò)增效率，并且獲得與單個(gè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR反應(yīng)相當(dāng)?shù)撵`敏度，特異性和可重復(fù)性。為此，SuperArray首先設(shè)計(jì)篩選出最佳的候選引物，接著通過(guò)實(shí)驗(yàn)，在不同反應(yīng)條件下，檢測(cè)PCR反應(yīng)體系與幾千條PCR引物的組合，最終獲得了優(yōu)化的引物和PCR反應(yīng)體系，適應(yīng)PCR芯片的要求。 

通過(guò)計(jì)算機(jī)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，引物達(dá)到以下要求：

1.特異性：通過(guò)BLAST等比對(duì)方法，檢測(cè)確認(rèn)引物在相應(yīng)物種（人，小鼠或大鼠）全基因組中的高度特異性，有效避免非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明引物不會(huì)擴(kuò)增E.coli基因組，后者是Taq DNA多聚酶的常見污染源。

2.均一性：所使用的引物的CG含量，解鏈溫度（Tm），以及其他一些化學(xué)的和物理的特性都相似，以保證在相同的PCR條件（尤其是相同退火溫度）下，芯片中的不同的基因都能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。

3.擴(kuò)增效率：引物擴(kuò)增的片段大小均在100到200bp左右，確保在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，不同的基因均能擴(kuò)增出完整片段；并增強(qiáng)引物3’ 端的鉚定能力，減少引物二聚體和非特異性退火的發(fā)生。

在基于SYBR Green的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中，PCR反應(yīng)體系也起到重要作用。嚴(yán)格控制的熱啟動(dòng)Taq酶是一個(gè)關(guān)鍵因素。RT² Real-Time^TM PCR反應(yīng)體系采用了一種獨(dú)特的，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)Taq酶，只有在熱激步驟之后，酶的活性才能完全發(fā)揮。在嚴(yán)格控制反應(yīng)條件的情況下，在較低溫度下發(fā)生的非特異性引物結(jié)合無(wú)法進(jìn)一步擴(kuò)增。其他的反應(yīng)體系則常常將這些模板進(jìn)一步擴(kuò)增成為非特異性產(chǎn)物，造成假陽(yáng)性結(jié)果。此外，Superarray還對(duì)RT² Real-Time^TM PCR反應(yīng)體系中的化學(xué)組分進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步減少了引物二聚體的形成，并能保證最難擴(kuò)增的片段都得到極高的擴(kuò)增效率。PCR芯片結(jié)合了高質(zhì)量的PCR引物設(shè)計(jì)和RT² Real-Time^TM PCR反應(yīng)體系，為PCR的高芯片質(zhì)量提供了保證。

表格2總結(jié)了RT²Profiler^TM PCR芯片的特點(diǎn)。

　

 

                       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

表2  RT²Profiler^TM PCR芯片的特點(diǎn)

 

研究者總是希望能檢測(cè)到表達(dá)量相當(dāng)?shù)偷幕�因，有時(shí)候，研究者得到的起始總RNA量也很少，但仍希望能進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。為了滿足研究者的這些需要，Superarray嚴(yán)格檢測(cè)了PCR芯片系統(tǒng)的靈敏度。例如，Superarray使用PCR芯片檢測(cè)了一系列總RNA樣本，這些樣本的濃度都不相同，使用的PCR芯片為炎癥細(xì)胞因子和受體基因芯片，通常，這些基因的表達(dá)量都是很低的。圖3將陽(yáng)性信號(hào)的比例（Ct<35的基因所占百分比）與相應(yīng)的總RNA量對(duì)應(yīng)起來(lái)作圖。結(jié)果表明，當(dāng)起始的總RNA范圍在5.0ng到1.0ug（甚至是5.0ug）時(shí)，每張PCR芯片的陽(yáng)性信號(hào)比率均超過(guò)85%。對(duì)于表達(dá)量更高的基因，芯片檢測(cè)的靈敏度還會(huì)大大提高，即在起始RNA量更低的情況下，芯片能夠檢測(cè)到的陽(yáng)性信號(hào)比例更高。值得注意的是，起始的總RNA量最好不要低于0.5-1.0ug，否則會(huì)造成陽(yáng)性信號(hào)損失。由于陽(yáng)性信號(hào)比例在起始RNA量低時(shí)會(huì)顯著下降，所以在實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)的最低RNA量不少于5.0ng。