超高效液相色譜法UPLC超越HPLC--色譜實(shí)驗(yàn)室的新高度

在過(guò)去30年間，高效液相色譜法（HPLC）已經(jīng)成為世界各地實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。這是因?yàn)镠PLC是一種強(qiáng)大的多用途技術(shù)。它的強(qiáng)大體現(xiàn)在其應(yīng)用范圍廣泛，覆蓋從毛細(xì)管級(jí)到制備級(jí)的各個(gè)范圍；在相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)范圍內(nèi)，它是一種多用途技術(shù)，能檢測(cè)多種化合物。從根本上說(shuō)，目前，HPLC技術(shù)的發(fā)展方向主要有三個(gè)方面：化學(xué)、檢測(cè)器和系統(tǒng)／數(shù)據(jù)管理。色譜法在這些方面的進(jìn)展使該技術(shù)得到了廣泛認(rèn)可。盡管如此，色譜技術(shù)仍有進(jìn)一步發(fā)展的空間。那么，HPLC的未來(lái)將是怎樣一幅圖景？后續(xù)有哪些發(fā)展成果能擴(kuò)大和延展這種公認(rèn)技術(shù)的功用？

UPLCTM的定義
液相色譜法的前沿技術(shù)正在研發(fā)中。北加利福尼亞大學(xué)的J. Jorgensen博士和楊百翰大學(xué)的M. Lee博士最近都發(fā)表了關(guān)于色譜實(shí)驗(yàn)室未來(lái)分析范圍的深刻見(jiàn)解。他們的研究為分離科學(xué)描繪了一幅新圖景。通過(guò)使用比以前小得多顆粒，使分離過(guò)程達(dá)到了一個(gè)新的終點(diǎn)。該方法的基本原理體現(xiàn)在范第姆特方程中。范第姆特方程是一個(gè)描述線速度與塔板高度（柱效）關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)式。
 
鑒于顆粒大小是變量之一，因此，它可用來(lái)描述各種顆粒大小的理論性能（圖1）。從圖1可以看出，一旦填料的顆粒大小低于2 μm，色譜技術(shù)就能達(dá)到一個(gè)新水平：不僅柱效更高，而且隨著流速的提高不會(huì)使柱效降低。

 
圖1：這些范第姆特曲線表明過(guò)去30年間顆粒大小的減小過(guò)程。理論塔板高度的降低意味著效率的提高。但即使是2.5 μm的顆粒，其效率也會(huì)在較高的流速下開(kāi)始下降，而系統(tǒng)反壓則會(huì)相應(yīng)增高。如果使用UPLCTM技術(shù)和2 μm以下的顆粒，那么即使在較高的線速度下，效率也能得以保持。更短色譜柱和／或更高流速的使用加快了分析速度，提高了分辨率和靈敏度，從而使現(xiàn)在有可能充分利用色譜原理進(jìn)行分離。
 
這就呈現(xiàn)了這樣一種情景：峰容量和分離速度均被提高至新的極限。簡(jiǎn)言之，峰容量被定義為色譜法每單位時(shí)間內(nèi)所能分辨的峰數(shù)量。峰容量和分離速度等性能指標(biāo)得到提高后的色譜法被稱為超高效液相色譜法，或UPLCTM。圖2說(shuō)明了當(dāng)顆粒大小從5 μm減小至1.7 μm時(shí)，增加的峰容量對(duì)色譜分離性能的影響。
 

圖2：比較5 μm顆粒與1.7 μm顆粒。峰容量和分辨率顯著增加。

速度、靈敏度和分辨率
源于更小顆粒的額外效率可帶來(lái)更多的明顯益處。更短的色譜柱或更高的流速加快了速度，同時(shí)小顆粒也提高了分辨率。對(duì)于任何給定的分離，都可通過(guò)調(diào)節(jié)這些變量而達(dá)到速度和分辨率的最佳組合。圖3顯示了UPLC與HPLC的速度比較結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)比較了相同分辨率下，3 μm顆粒和1.7 μm顆粒的分離速度；結(jié)果表明較小顆粒的分離速度更快。效率的提高還帶來(lái)了進(jìn)一步的益處：靈敏度提高。由于分離過(guò)程中的區(qū)帶變窄，因此分析物會(huì)更集中在檢測(cè)點(diǎn)上。當(dāng)考慮UPLC的儀器設(shè)計(jì)要求時(shí)，將對(duì)這一點(diǎn)進(jìn)行更詳細(xì)的論述。

應(yīng)該指出的是：3 μm是15 cm長(zhǎng)普通色譜柱顆粒大小的極限。這是在色譜柱達(dá)到最佳流速而又不超出市售儀器（使用任何配比的甲醇－水混合溶劑）的壓力限制范圍的條件下，運(yùn)行系統(tǒng)所能使用的最小顆粒大小。（注意：迄今為止，用于HPLC的最小顆粒是0.67 μm [3]。）
 
如上文所述，范第姆特方程式（及其曲線）表明有必要使用2 μm以下的顆粒，以實(shí)現(xiàn)柱效的提高。因此，需要能使UPLC構(gòu)想得以應(yīng)用于色譜實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)革新2。
 

圖3：頂部的色譜圖是分別使用普通（3 μm）HPLC和1.7 μm UPLC得出的5組分混合樣品疊加圖譜。底部的色譜圖是分離過(guò)程的前6分鐘的展開(kāi)圖，表明UPLC提高了分離速度而又使分辨率保持不變。UPLC的溶劑用量也大幅度減少。

更小的顆粒，更大的峰容量
研制并填充2 μm以下的顆粒至可重現(xiàn)而耐用的色譜柱中本身就是一個(gè)挑戰(zhàn)。圖4顯示出了目前實(shí)驗(yàn)室常用的5 μm顆粒與建議用于UPLC柱的更小的1.7 μm顆粒的明顯差異。目前，非多孔型1.5 μm顆粒已經(jīng)上市。雖然這類顆粒效率較高，但它們的缺點(diǎn)是表面積較小。表面積小會(huì)導(dǎo)致載樣量小和保留時(shí)間短。為了與HPLC保持相近的保留時(shí)間和載樣量，UPLC必須使用多孔型顆粒。UPLC需要一種新穎的耐高壓多孔型顆粒。填充床的均勻性也是至關(guān)重要的；特別是當(dāng)較短的色譜柱用以保持分辨率的穩(wěn)定，而同時(shí)又要達(dá)到加快分離速度的目標(biāo)時(shí)。另一項(xiàng)要求是色譜柱的內(nèi)表面必須足夠光滑，以便于填充較小顆粒。應(yīng)重新設(shè)計(jì)色譜柱兩端的篩板，使之既能留住小顆粒又能避免堵塞。

圖4：為了說(shuō)明5 μm顆粒和1.7 μm顆粒的顯著差異，該掃描電子顯微圖將兩種顆粒與60 μm的人體頭發(fā)相比較。在測(cè)量距離相同時(shí)，該頭發(fā)的直徑約等于12個(gè)5 μm的顆粒，33個(gè)1.7 μm的顆粒。

UPLC系統(tǒng)的設(shè)計(jì)要求
為了達(dá)到顆粒小、峰容量大的分離效果，需要比目前使用的HPLC儀具有更廣的壓力范圍。在能達(dá)到最大效率的最佳流速下，對(duì)于10 cm長(zhǎng)裝有1.7 μm顆粒的色譜柱，計(jì)算得出的壓力降是~15,000 psi。因此，需要一個(gè)能在該壓力下傳送溶劑的泵。另一方面的考慮是在這些條件下，溶劑的可壓縮性將會(huì)變得顯著，特別是在多溶劑和梯度分離條件下。UPLC的溶劑傳送系統(tǒng)應(yīng)不僅僅具有高壓泵抽吸功能，同時(shí)在等度和梯度分離模式下使用各種溶劑，溶劑傳送系統(tǒng)必須能抵消溶劑可壓縮性引起的大范圍潛在壓力波動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)平穩(wěn)而可重現(xiàn)的流體輸送。

進(jìn)樣也是很關(guān)鍵。普通進(jìn)樣閥，不論是手動(dòng)的還是自動(dòng)的，都不具有極端壓力下的耐用功能。進(jìn)樣的可重現(xiàn)性和線性的典型性能標(biāo)準(zhǔn)是分析應(yīng)用所需要的，但其它特征也是必要的。為保護(hù)色譜柱免受極端壓力波動(dòng)的影響，進(jìn)樣過(guò)程應(yīng)盡可能排除脈沖干擾。儀器的系統(tǒng)體積要小，以減小所檢測(cè)樣品可能的區(qū)帶展寬。在快速進(jìn)樣循環(huán)中，UPLC能以最大速度、較大的樣品通量進(jìn)行工作，并可長(zhǎng)時(shí)間不需人工照看。同時(shí)低體積進(jìn)樣量和最小的交叉污染很好匹配了靈敏度的提高。
 
理論情況下，配備1.7 μm顆粒的UPLC系統(tǒng)能產(chǎn)生半峰寬小于1秒的檢測(cè)峰。這給UPLC檢測(cè)帶來(lái)了挑戰(zhàn)。首先，檢測(cè)器必須具有較高的采樣速率，以在檢測(cè)峰通過(guò)時(shí)捕捉足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)，從而對(duì)分析物的檢測(cè)峰進(jìn)行準(zhǔn)確而可重現(xiàn)的識(shí)別（和積分）。其次，檢測(cè)器必須有最小的擴(kuò)散體積，以確保分離效率不降低。檢測(cè)器的光學(xué)部件也必須具有能體現(xiàn)UPLC靈敏度優(yōu)勢(shì)的性能指標(biāo)。從概念上講，對(duì)于不同的檢測(cè)技術(shù)，UPLC檢測(cè)的靈敏度應(yīng)是HPLC分離靈敏度的2-3倍（圖5）。例如，質(zhì)譜檢測(cè)會(huì)極大得益于UPLC的性能特征。檢測(cè)峰濃度的提高以及較低流速（不需分流）下減少的色譜擴(kuò)散將會(huì)促進(jìn)離子源效率的提高，從而使與UPLC相連的質(zhì)譜儀的靈敏度至少提高3倍。

圖5：在進(jìn)行高峰容量的色譜分析時(shí)，降低分析物的色譜展寬可能有助于提高靈敏度。

全面的系統(tǒng)方法
通過(guò)思考色譜過(guò)程以及如何將這些原理應(yīng)用于UPLC后明顯發(fā)現(xiàn)：除了化學(xué)、泵、進(jìn)樣器和檢測(cè)器之外，還需要對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行考慮。系統(tǒng)的體積至關(guān)重要。如果要在色譜分析過(guò)程中保持UPLC分離的高性能，則UPLC的系統(tǒng)總體積必須大大低于目前的HPLC系統(tǒng)。還有一點(diǎn)也關(guān)鍵：那就是不僅要仔細(xì)考慮上文提到的系統(tǒng)部件的性能規(guī)范，而且需要仔細(xì)考慮連接管和接頭配件。為了使UPLC的良好性能得以廣泛應(yīng)用，有必要制定全面的系統(tǒng)方法，其中既包括所需的性能規(guī)范，也包括對(duì)附件變量的控制。

在色譜實(shí)驗(yàn)室可充分發(fā)揮UPLC系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，給實(shí)驗(yàn)室?guī)��?lái)更多益處。用于特征分析的高通量庫(kù)篩選能以較快的速度或較好的分辨率完成，而這兩點(diǎn)都能轉(zhuǎn)變?yōu)樾�率的提高。代謝物的識(shí)別和生物分析將得益于速度、分辨率和靈敏度的提高。肽圖時(shí)間可顯著縮短以加快表征過(guò)程。對(duì)于肽研究而言，UPLC系統(tǒng)得出圖譜的峰容量更大，比目前使用的HPLC得出的圖譜更精確。穩(wěn)定性指示方法以及方法的總體開(kāi)發(fā)將會(huì)使每次進(jìn)樣得出更多的信息，同時(shí)還會(huì)縮短分離時(shí)間。色譜分離技術(shù)的最普遍用途——定量分析可以得到更快的的速度，更好的基線分離，從而將會(huì)更容易、更可重現(xiàn)進(jìn)行定量積分，增加了實(shí)驗(yàn)室的生產(chǎn)力和可信度。

UPLCTM：重新定義色譜實(shí)驗(yàn)室
許多科學(xué)家曾一度遇到分離障礙，而目前正致力于突破普通HPLC的極限；超高效液相色譜法為擴(kuò)大和延展這種廣泛應(yīng)用的分離技術(shù)提供了可能（圖6）。由于UPLC技術(shù)能實(shí)現(xiàn)提高液相色譜速度、分辨率和靈敏度的承諾，為每次分析提供更多的信息；因此，該技術(shù)將會(huì)得到實(shí)驗(yàn)室的廣泛認(rèn)可。

圖6：UPLC呈現(xiàn)出全新的速度、分辨率和靈敏度，將會(huì)重新定義色譜實(shí)驗(yàn)室。

參考文獻(xiàn)
[1] Anton D. Jerkovich, J. Scott Mellors, and James W. Jorgenson, "The Use of Micrometer-Sized Particles in Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography," LCGC North America Volume 21, Number 7 (2003).
[2] N. Wu, J.A. Lippert, and M.L. Lee, "Practical Aspects of Ultrahigh Pressure Capillary Liquid Chromatography," J. Chromatogr. 911, 1 (2001).
N. Wu, D.C. Collins, J.A. Lippert, Y. Xiang, and M.L. Lee, "Ultrahigh Pressure LiquidChromatography/Time-of-Flight Mass Spectrometry for Fast Separations," J. Microcol. Sep. 12, 462 (2000).
[3] J. M. Cintron, L. A. Colon, "Organo-silica Nanoparticles Used in Ultrahigh- Pressure Liquid Chromatography," The Analyst, 127 (2002) 701 - 704.

沃特世公司
美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德市Maple街34號(hào)，01757
電話：1 508 478 2000
傳真：1 508 872 1990