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用陣列式SPR傳感器ProteOn XPR36系統(tǒng)進(jìn)行抗體開(kāi)發(fā)和研究

瀏覽次數(shù)：6021　發(fā)布日期：2010-1-12　來(lái)源：Bio-Rad

進(jìn)行抗體開(kāi)發(fā)和研究，不管是完整的單克隆抗體分子還是Fab、scFv，我們需要了解抗體分子的表達(dá)量、親和力、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（特別是解離速率k_off）以及抗體的其它特性如亞型、特異性等等。使用傳統(tǒng)的ELISA方法篩選抗體，通常只能先看哪些克隆有表達(dá)，然后把表達(dá)水平較高的克隆挑出來(lái)進(jìn)一步研究。這種方法篩選抗體，速度雖然快，但充其量只能知道大致的表達(dá)水平，其余所有的信息都必須進(jìn)一步研究，對(duì)后續(xù)的工作帶來(lái)很大壓力，而且常常會(huì)丟掉雖然表達(dá)水平不高，但抗體親和力、特異性等非常好的克隆。

后來(lái)，人們嘗試用一些新的手段來(lái)篩選抗體或抗體片段，其中較常用的是SPR技術(shù)。SPR生物傳感器技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，它的通量一直成為問(wèn)題，測(cè)定抗原-抗體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)通常需要數(shù)小時(shí)時(shí)間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到抗體篩選的要求，而通量較高的產(chǎn)品的價(jià)格又貴得幾乎能令世界上最奢侈的實(shí)驗(yàn)室望而卻步，所以大多數(shù)擁有SPR傳感器的實(shí)驗(yàn)室只是拿它來(lái)做后期的抗體特性分析。前期的篩選階段還是采用ELISA方法。

現(xiàn)在Bio-Rad公司推出的一種新型陣列式SPR生物傳感器技術(shù)有望徹底打破現(xiàn)有方法的各種瓶頸，做到較高通量的基礎(chǔ)上同時(shí)獲得濃度、親和力以及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等相關(guān)數(shù)據(jù)。這種新型陣列式SPR生物傳感器叫ProteOn XPR36系統(tǒng)。如下圖所示，它具有可90°旋轉(zhuǎn)的6通道流動(dòng)池，可在芯片上產(chǎn)生縱向或者橫向的通道各6條。首先，流動(dòng)池旋轉(zhuǎn)成縱向，在縱向的6個(gè)通道里可以標(biāo)記最多6種不同的ligand在芯片上，隨后流動(dòng)池旋轉(zhuǎn)90°變成橫向，流過(guò)6個(gè)analyte，當(dāng)analyte溶液接觸原先標(biāo)記的ligand時(shí)發(fā)生的相互作用即可被檢測(cè)并記錄下來(lái)。通過(guò)這樣的分析方式可以實(shí)現(xiàn)高通量平行分析。

使用ProteOn XPR36系統(tǒng)進(jìn)行抗體篩選和優(yōu)化，Bio-Rad公司給出了一個(gè)完全不同于傳統(tǒng)方法的新工作流程，如下圖所示。
   第一步，橫向6個(gè)通道上標(biāo)記捕獲試劑，即可以和單抗結(jié)合的分子，如Anti-mouse IgG、Protein A/G等，如果篩選抗體Fab段，可以標(biāo)記Anti-(Fab’)₂。標(biāo)記完成后，通道旋轉(zhuǎn)90°變成縱向，進(jìn)入第二步。
    第二步是從細(xì)胞培養(yǎng)液中捕獲單抗，一次最多流過(guò)6個(gè)克隆。如果表達(dá)有單抗，儀器會(huì)顯示出一條向上的曲線，并且濃度越高，曲線上升得越快。如果定義了標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以把濃度數(shù)值算出來(lái)。這一步完成后，抗體或抗體片段就結(jié)合在了捕獲試劑上。
    第三步，通道再轉(zhuǎn)回橫向，流過(guò)5個(gè)不同濃度的抗原分子加一個(gè)緩沖液作為陰性對(duì)照。這一步可以得出下圖右下方所示的6幅動(dòng)力學(xué)反應(yīng)曲線，分別代表6個(gè)克隆的單抗和抗原反應(yīng)的結(jié)果，我們可以據(jù)此計(jì)算出6個(gè)抗體和抗原的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和親和力常數(shù)。
第四步，用磷酸或pH2.0的甘氨酸溶液再生，把抗原連同抗體一塊兒從捕獲試劑上洗下來(lái)，為檢測(cè)下一批單抗做準(zhǔn)備。

按照這一流程，每個(gè)循環(huán)可以測(cè)定6個(gè)克隆的表達(dá)水平和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。當(dāng)所有克隆都檢測(cè)完畢后，我們可以繪制一張包含所有克隆的動(dòng)力學(xué)分布圖，如下圖所示。

上圖縱坐標(biāo)代表解離速率常數(shù)（k_off），橫坐標(biāo)代表結(jié)合速率常數(shù)（k_on），斜線是等親和力線，也就是說(shuō)分布在同一條等親和力線上的克隆親和力是一樣的。我們可以根據(jù)需要挑選特定區(qū)域內(nèi)的克隆，然后進(jìn)行抗體特性分析。

這一流程的好處是初步篩選得到大量的抗體信息，基本不需要再挑克隆進(jìn)行第二步篩選就可以直接把我們需要的克隆挑出來(lái)純化或者進(jìn)行進(jìn)一步分析，確定其亞型、抗原識(shí)別表位等。

有人也許會(huì)問(wèn)一些問(wèn)題，現(xiàn)在就這些問(wèn)題回答如下：

1．這樣做一天能篩選多少克��？

答：200個(gè)左右。這個(gè)數(shù)字聽(tīng)起來(lái)似乎令人沮喪，但別忘了，這是包含大量信息的篩選，一步能頂傳統(tǒng)方法多步的工作，其實(shí)更省時(shí)間。

2．需要耗費(fèi)的捕獲試劑和抗原量很多嗎？

答：一點(diǎn)也不多，捕獲試劑大約消耗數(shù)微克，抗原消耗則需要根據(jù)篩選的克隆數(shù)來(lái)定，如果篩1000個(gè)克隆，抗原消耗通常不超過(guò)1毫克。

3．整個(gè)流程的成本高嗎？

答：一點(diǎn)也不高，只需一塊芯片就能完成上千克隆的篩選，和其它消耗加在一起的總成本只比ELISA高一點(diǎn)。如果考慮傳統(tǒng)方法篩選完成后可能還需測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，其實(shí)這樣做的成本會(huì)更低

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