實(shí)時(shí)熒光定量PCR的研究進(jìn)展及其應(yīng)用

 

 (張蓓，沈立松  上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬新華醫(yī)院上海兒童醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)診斷中心)

摘要:多聚酶鏈反應(yīng)飛速的發(fā)展使其成為了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室重要的工具，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitative PCR)技術(shù)以其敏感性高、重復(fù)性好、速度快和污染少使PCR技術(shù)又向前邁進(jìn)了一步。本文對(duì)real-timeQ-PCR技術(shù)的原理、五種主要的熒光化學(xué)及定量方法作一介紹，同時(shí)也討論了此技術(shù)存在的不足，并對(duì)其目前在研究領(lǐng)城中主要的應(yīng)用進(jìn)行了概述。

多聚酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)發(fā)明至今已近20年了，在這期間其技術(shù)得到了不斷的發(fā)展，近年來(lái)出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，本文就此技術(shù)及其應(yīng)用做一綜述。

1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的方法學(xué)

1.1原理
所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)

程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5'核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光標(biāo)記探針，因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time令PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。

 

PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對(duì)PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-timeQ-PCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推斷模板最

初的含量。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在real-timeQ-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一個(gè)熒光信號(hào)的域值，一般這個(gè)域值(threshold)是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)(baseline),熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測(cè)到的熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(CO.Ct值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

1.2熒光化學(xué)

目前real-timeQ-PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是:DNA結(jié)合染色，水解探針，分子信標(biāo)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測(cè)兩大類(lèi)。

擴(kuò)增序列非特異性檢測(cè)方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBRgreen1[33等熒光染料。Real-timeQ-PCR發(fā)展早期就是運(yùn)用這種最簡(jiǎn)單的方法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBRgreen1熒光染料，SYBRgreen1熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)。熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于它能監(jiān)測(cè)任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。引物二聚體的問(wèn)題目前可以用帶有熔解曲線(meltingcurve)分析的軟件加以解決。

擴(kuò)增序列特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的墓因特異寡核普酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策略川。目前在real-timeQ-PCR中最廣泛使用的TagMan系統(tǒng)就是運(yùn)用了這個(gè)原理。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核普酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，此時(shí)5，端熒光墓團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3’端熒光淬滅墓團(tuán)(發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET)，因此探針完整時(shí)，檢測(cè)不到該探針5'端熒光墓團(tuán)發(fā)出的熒光。但在PCR擴(kuò)增中，溶液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿摸板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5'-3'外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)將探針5'端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3，端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

 

直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光。分子信標(biāo)(molecularbeacon)['〕就屬于這一類(lèi)，它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針?lè)肿映拾l(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí)，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光墓團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅墓團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光。熒光標(biāo)記引物是從分子信標(biāo)的概念變化而產(chǎn)生的一種聯(lián)合分子探針系統(tǒng)，它把熒光基團(tuán)標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合，從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。目前主要有兩種:日出引物(sunriseprimes)和蝎子引物(scorpionprimes)。雜交探針(hybridizationprobe)使用兩個(gè)特異的探針，其中上游的探針的3'端標(biāo)記有供體熒光素(donor)，而下游的探針的5‘端標(biāo)記有受體熒光素(acceptor)。在PCR中模板退火階段，兩探針同時(shí)與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，并形成頭尾結(jié)合的形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能f轉(zhuǎn)移(FRET，此作用與上述水解探針的方式相反)，使得受體熒光墓團(tuán)發(fā)出熒光;當(dāng)兩探針處于游離狀態(tài)時(shí)，無(wú)熒光產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運(yùn)用了兩個(gè)探針，因此增加了方法的特異性，另外也可利用熒光寡核普酸熔解曲線(meltingcurve)對(duì)與寡核普酸探針結(jié)合的序列進(jìn)行分析，從中獲取有用的信息。

1.3定量方法

在real-timeQ-PCR中，模板定量有兩種策略:相對(duì)定t和絕對(duì)定。相對(duì)定t指的是在一定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本的f的變化。絕對(duì)定t指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知的樣本的to

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定f由于在此方法中f的表達(dá)是相對(duì)于某個(gè)參照物的f而官的，因此相對(duì)定f的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備，對(duì)于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只要知道其相對(duì)稀釋度即可。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中樣本的靶序列的t來(lái)自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終必須除以參照物的t，即參照物是1，的樣本，其它的樣本為參照物t的n倍。在實(shí)驗(yàn)中為了標(biāo)準(zhǔn)化加入反應(yīng)體系的RNA或DNA的，往往在反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增一內(nèi)源控制物，如在墓因表達(dá)研究中，內(nèi)源控制物常為一些管家墓因(如beta-actin,3-磷酸甘油醛脫氮酶UAPDH等)。

1.3.2比較CT法的相對(duì)定量比較CT法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定t的不同之處在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)t，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)I，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來(lái)反應(yīng)起始模板的量，一個(gè)循環(huán)(CT=1)的不同相當(dāng)于起始棋板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以靶墓因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率墓本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對(duì)定量此方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定f的不同之處在于其標(biāo)準(zhǔn)品的量是預(yù)先已知的。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常作為絕對(duì)定f標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的f可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來(lái)轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來(lái)確定。

2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

Real-timeqPCR的應(yīng)用范圍很廣泛，包括mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核普酸多態(tài)性(SNPs)的測(cè)定等。以下就目前real-timeQ-PCR在易位墓因的檢測(cè)，細(xì)胞因子的表達(dá)分析，腫瘤耐藥墓因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用作一概述。

 

2.1微小殘留病變的檢測(cè)腫瘤疾病尤其是血液的惡性腫瘤

常伴有特異性基因的易位，這種易位往往可以作為監(jiān)測(cè)臨床治療效果的一種腫瘤標(biāo)志。雖然在過(guò)去的幾十年里治療方案的改進(jìn)已大大地延長(zhǎng)了病人的生存期，但是緩解期的病人仍存在復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性。因此微小殘留病變(MRD)的檢測(cè)對(duì)于進(jìn)一步調(diào)整治療方案是至關(guān)重要的。Real-timeQ-PCR的應(yīng)用正成為檢測(cè)腫瘤微小殘留分子標(biāo)志的一種必備的研究工具。通過(guò)對(duì)腫瘤融合基因的定量測(cè)定能指導(dǎo)臨床對(duì)病人實(shí)行個(gè)體化的治療。急性粒細(xì)胞性白血病(AML)最常見(jiàn)的染色體異常是交互易位t(8;21)(g22;q22)，在這易位中，AML-1轉(zhuǎn)錄因子基因和

8號(hào)染色體的MTG8基因發(fā)生融合，致使正常的AML-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到影響，這可能是白血病的病因。目前的研究[1o〕證明用real-timeqPCR來(lái)檢測(cè)融合基因有助于對(duì)這些病人的MRD進(jìn)行定量，其作為預(yù)后的指標(biāo)或?qū)χ委煼桨傅脑u(píng)估是有價(jià)值的。同樣的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)的BCR-ABI_融合墓因〔”氣急性琳巴細(xì)胞性白血病(ALL)的白血病特異的TEL-AML1融合基因〔iz],濾泡狀琳巴瘤(Fl,)的染色體易位t(14;18)(g32;g21)[Is」和bel-2重排C14〕等。許多研究都在很大程度上受益于real-timeQ-PCR方法的應(yīng)用，隨著技術(shù)的發(fā)展，Real-timeQ-PCR的運(yùn)用將不斷地?cái)U(kuò)大。

2.2細(xì)胞因子的表達(dá)分析細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)蛋白，它通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)(包括琳巴細(xì)胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系統(tǒng)中起若核心作用。許多不同類(lèi)型的細(xì)胞都能分泌這種低分子f的蛋白質(zhì)，其中包括琳巴細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。細(xì)胞因子可被分為不同的組:白介素(II.1-"IL-23)，干擾紊(IFN-+,IFN-Y等)，集落刺激因子(CSF),腫瘤壞死因子(TNF),腫瘤生長(zhǎng)因子(TGF-月等)和化學(xué)因子(MCP-1,MIP-1等)[I]。為了闡明在許多炎癥反應(yīng)，自身免疫性疾病和器官移植排異中的免疫致病途徑，細(xì)胞因子

mRNA表達(dá)譜的可靠定t是很重要的。盡管被檢樣本中細(xì)胞因子含t往往極低，然而real-time反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)以其高敏感性和準(zhǔn)確性在細(xì)胞因子的定f中越來(lái)越受到青睞。

2.3腫瘤耐藥薈因裹達(dá)的研究對(duì)化療藥物的耐藥是治療腫瘤病人的主要障礙。由于耐藥限制了許多腫瘤的成功治療，因此研究腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制就變得十分重要。目前研究中發(fā)現(xiàn)主要的耐藥機(jī)制有:ATP結(jié)合盒墓因超家族(ATP-bindingcassettesuperfamily)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的耐藥[15]，這些蛋白包括:MDR-1墓因編碼的P-槍蛋白(P-gp)，多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)，肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)，乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)等，酶介導(dǎo)的耐藥，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo)，谷朧甘膚(GSH)及谷朧甘膚-S-轉(zhuǎn)移晦(GST),蛋白激酶C(PKC)，脫氧胞喻健核普激酶(deoxycytidinekinase)等;凋亡墓因介導(dǎo)的耐藥[“〕，如bcl-2家族，p53墓因，c-myc等。多藥耐藥(MDR)是多因素，多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。real-time反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)是了解腫瘤耐藥，指導(dǎo)臨床治療策略的有用手段，它能觀測(cè)用藥前后及復(fù)發(fā)時(shí)腫瘤細(xì)胞的耐藥墓因mRNA表達(dá)變化，從而及時(shí)調(diào)整治療方案和評(píng)價(jià)疾病的預(yù)后。

2.4病毒感染的定f監(jiān)測(cè)擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展使得對(duì)病毒的定性或定t檢測(cè)的能力隨之提高，也使研究病毒的負(fù)荷和疾病進(jìn)展的關(guān)系成為可能。Real-timeQ-PCR是主要被運(yùn)用于科研和診斷領(lǐng)域的擴(kuò)增技術(shù)，它不僅能對(duì)病毒定性，而且由于其實(shí)驗(yàn)的批間和批內(nèi)差異小，重復(fù)性好，因此能方便、快速、靈敏、準(zhǔn)確地定量病毒DNA或RNA的序列，更重要的是從中可以動(dòng)態(tài)地研究在整個(gè)病程中潛在病毒的復(fù)活或持續(xù)，從而使臨床醫(yī)生和病毒學(xué)家能檢測(cè)臨床的變化，如抗病毒治療的效果，耐藥變異的出現(xiàn)等。目前運(yùn)用較多的是在器官移植中對(duì)使用免疫抑制劑的病人用Real-timeQ-PCR來(lái)定量測(cè)定CMV感染。研究表明在骨髓移植的病人中用Real-timeQ-PCR檢測(cè)CMV感染比傳統(tǒng)的pp65抗原試驗(yàn)更敏感，抗CMV藥物治療能使血中的病毒含量下降，Real-timeQ-PCR對(duì)于快速定量骨移植病人的CMV感染和監(jiān)測(cè)CMV復(fù)活是一個(gè)有用的工具。

3存在的問(wèn)題及應(yīng)用前景

在real-time令PCR技術(shù)中，無(wú)論是相對(duì)定量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的問(wèn)題有侍解決。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個(gè)必不可少的過(guò)程。目前由于無(wú)一統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性。此外，用:eal-timeqPCR來(lái)研究mRNA時(shí)，受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。在相對(duì)定量中，其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實(shí)驗(yàn)條件的影響的，合理地選擇合適的不受實(shí)驗(yàn)條件影響的內(nèi)源控制物也是實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。另外，與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，Real-timeQ-PCR的不足之處是[18]:(1)由于運(yùn)用了封閉的檢測(cè)，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測(cè)步驟，因此也就不能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小;(2)因?yàn)闊晒馑胤N類(lèi)以及檢測(cè)光源的局限性，從而相對(duì)地限制了real-timeQ-PCR的復(fù)合式multiplex)檢測(cè)的應(yīng)用能力;(3)目前real-timeQ-PCR實(shí)驗(yàn)成本比較高，從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。隨著技術(shù)不斷改進(jìn)和發(fā)展，目前real-timeQPCR已成為科研的主要工具，該技術(shù)未來(lái)的應(yīng)用前景是令人鼓舞的，一方面real-timeQ-PCR技術(shù)與其它分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合使定量極微量的基因表達(dá)或DNA拷貝數(shù)成為可能。另一方面熒光標(biāo)記核酸化學(xué)技術(shù)和寡核普酸探針雜交技術(shù)的發(fā)展以及real-time技術(shù)的應(yīng)用，使定量PCR技術(shù)有一個(gè)足夠的基礎(chǔ)為廣大臨床診斷實(shí)驗(yàn)室所接受，將有助于臨床醫(yī)生對(duì)疾病的診斷和治

療。

4結(jié)語(yǔ)

Real-timeqPCR的發(fā)展使得研究人員又多了一種比較簡(jiǎn)單且自動(dòng)化的手段去研究許多重要的基礎(chǔ)課題。雖然此技術(shù)仍存在一些不足需要改進(jìn)，但是它為real-timeQ-PCR在常規(guī)診斷檢測(cè)中的運(yùn)用打下了良好的基礎(chǔ)oReal-timeQ-PCR將成為未來(lái)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的研究工具。