原位雜交HPV DNA檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用及體會(huì)

原位雜交技術(shù)是新近開展的一項(xiàng)新技術(shù)，其原理是采用熒光、生物素、地高辛等標(biāo)記的探針，依據(jù)堿基對(duì)互補(bǔ)配對(duì)原理，與組織切片、細(xì)胞制片等標(biāo)本中的靶序列特異雜交，經(jīng)信號(hào)放大顯色后，鏡下觀察結(jié)果。此方法具有很高的靈敏性和特異性。本文就HPV DNA檢測(cè)技術(shù)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的操作體會(huì)等問題，總結(jié)如下。

 

1．1材料南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科2006～2007年肛腸外科肛周手術(shù)病例。其中男性患者45例，女性55例，平均55歲。試劑均購(gòu)自福建泰普公司的HPV高危型、低危型試劑盒。

1．2．1切片處理將4Ixm厚組織切片粘附在APES處理的載玻片上。

1．2．2脫蠟玻片經(jīng)二甲苯3次X20min，100％乙醇2次X3min，95％乙醇1次×3min，70％乙醇1次×3min，蒸餾水2移(X3min。

1．2．3微波修復(fù)將切片放入盛有1×雜交增強(qiáng)液的容器里，微波高火狀態(tài)煮30min，自然冷卻至不燙手，蒸餾水浸片2次×2min。

1．2．4雜交(1)小心擦干切片后，每張切片可根據(jù)組織的大小滴加適量的探針約25 l，并加蓋蓋玻片。(2)把切片放置于95℃的原位雜交加熱器上變性5arin。(3)放入裝有30％濕盒增效液的濕盒中，37℃，孵育4～16h(<16h)。(4)48oCPBS浸片，約2rain，小心移去蓋玻片，并擦掉組織周圍的探針，48oC PBS繼續(xù)浸泡10min。(5)然后48℃PBS繼續(xù)浸片3次×5min。

1．2．5信號(hào)放大與顯色(1)擦去組織周圍的液體，滴加適量的一抗(約50 1)，37℃，水濕盒中孵育30min，37℃PBS浸片3次X2min(輕微振蕩容器)。(2)擦去組織周圍的液體，滴加適量的二抗(約50 1)，室溫，水濕盒中孵育20min， P B S 浸片3 次× 2 m i n 。( 3 ) 擦去組織周圍的液體，滴加適量的H R P 聚合物( 約5 0 ¨1 ) ，室溫，水濕盒中孵育3 0 ra i n 。( 4 ) 小心擦去組織周圍的液體， 滴加適量的D A B 顯色劑( 約

5 0 ul ，根據(jù)組織的大小增減D A B 的量) ， P B S 終止顯色。( 5 ) 自來水沖洗殘留的D A B ， 蘇木精復(fù)染， 鹽酸乙醇分化， 氨水反藍(lán)，梯度乙醇脫水， 二甲苯透明，封固。

1 ． 2 ． 6 陽(yáng)性結(jié)果判斷上皮細(xì)胞核呈棕褐色著色為主。

 

每例標(biāo)本均做2 張切片， 分別用高危和低危型探針標(biāo)記。每批切片標(biāo)記均設(shè)高危和低危陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果：高危型6 3 ． 5 ％ ，低危型2 9 ． 5 ％ ， 陰性7 ％ ， 高、低同時(shí)感染約4 5 ． 5 ％ ( 圖1 ～ 4 ) ， 說明肛周組織中存在廣泛的H P V 感染， 而肛周H P V 感染是否直接致瘤或致癌， 還有待于大樣本的系統(tǒng)研究。

 

H P V 屬于乳頭瘤病毒科，是一種環(huán)狀雙鏈D N A 病毒，長(zhǎng)約8 k b。目前發(fā)現(xiàn)的H P V 亞型有2 0 0 種㈦。其主要通過直接或間接的接觸或性傳播感染人類， 引起人類皮膚和黏膜的多種良性乳頭狀瘤或疣，某些亞型的感染具有很強(qiáng)的致癌性。近年來隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，我們可從分子的水平更早期的、更準(zhǔn)確地， 檢測(cè)出低拷貝數(shù)下的病毒感染情況”。該技術(shù)目前已廣泛用于宮頸癌的早期的診斷及其它部位病變、病因?qū)W等方面的研究。原位雜交方法雖然容易掌握， 但要達(dá)到滿意結(jié)果， 還需要在制片過程中注意以下幾點(diǎn)。

3 ． 1 前期處理( 1 ) 組織固定液采用1 0 ％ 中性福爾馬林或4 ％ 多聚甲醛磷酸鹽緩沖液( p H 7 ． 4 ) ；( 2 ) 切片厚度3 — 4¨m ；( 3 ) 烤片溫度大于6 0 ℃ ， 時(shí)間1 h 左右；( 4 ) 建議使用A P E S 處理過的干凈載玻片， 以減少掉片。

3 ． 2 操作要點(diǎn)( 1 ) 二甲苯要及時(shí)更換， 保證組織脫蠟的干凈；( 2 ) 微波處理須高火，保證3 0 m i n，期間注意補(bǔ)充雜交增強(qiáng)液， 防止干片；( 3 ) 如果使用酶消化， 由于不同的組織，組織存放的時(shí)間不同以及切片厚度等存在差異，需要有針對(duì)性地摸索最佳消化條件；( 4 ) 蓋玻片與組織打大小相匹配，保證在高溫9 5 ℃ 變性過程中不于片；( 5 ) 建議使用專用的原位雜交儀或變性設(shè)備進(jìn)行高溫變性， 以保證變性溫度的準(zhǔn)確；( 6 ) 雜交溫度應(yīng)保持在3 7 ℃ ， 過高或過低會(huì)造成陽(yáng)性信號(hào)減弱或背景升高；( 7 ) 雜交時(shí)間為4 ～ 1 6 h 為宜，建議過夜為佳， 以提高低拷貝數(shù)病毒的檢出率；( 8 ) 在雜交過夜過程中， 要配有3 0 ％ 增效液的濕盒， 以降低水份對(duì)探針稀釋的可能性；( 9 ) 3 0 ％ 增效液的濕盒可以重復(fù)使用， 但建議每次使用前補(bǔ)充適量的蒸餾水，避免因增效液濃度升高造成背景升高；( 1 0 ) 雜交之后請(qǐng)使用4 8 ℃ 高溫充分浸片， 以除去非特異性雜交；( 1 1 ) P B S 緩沖液的p H 值應(yīng)在7 ． 4 ～ 7 ． 6 之間， 保證最佳洗滌效果；( 1 2 ) D A B 顯色液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用， 以保證顯色效果。

（臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志 周偉  ，耿建祥等 ）