表面等離子共振技術(shù)在蛋白-蛋白相互作用的應(yīng)用

應(yīng)用領(lǐng)域
結(jié)合特異性、抗體選擇、抗體質(zhì)控、疾病機(jī)制、藥物發(fā)明、生物治療、生物處理、生物標(biāo)記物、配體垂釣、基因調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、親和層析、結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系、小分子間相互作用等

檢測(cè)原理
表面等離子共振（SPR）是一種光學(xué)現(xiàn)象，可被用來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤在天然狀態(tài)下生物分子間的相互作用。這種方法對(duì)生物分子無(wú)任何損傷，且不需任何標(biāo)記物。
先將一種生物分子（靶分子）鍵合在生物傳感器表面，再將含有另一種能與靶分子產(chǎn)生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流經(jīng)生物傳感器表面。生物分子間的結(jié)合引起生物傳感器表面質(zhì)量的增加，導(dǎo)致折射指數(shù)按同樣的比例增強(qiáng)，生物分子間反應(yīng)的變化即被觀察到。這種反應(yīng)用反應(yīng)單位（RU）來(lái)衡量：1 RU = 1pg 蛋白/mm2 = 1 x 10-6 RIU（折射指數(shù)單位）。
分析物在被注入的過(guò)程中，由對(duì)流和擴(kuò)散流經(jīng)相互作用表面而與靶分子形成復(fù)合物，導(dǎo)致分析物濃度改變。微射流系統(tǒng)內(nèi)nL數(shù)量級(jí)流動(dòng)通道的應(yīng)用，使得這種濃度的改變降至最低點(diǎn)，以確保高傳質(zhì)系數(shù)（Mass Transport Coefficient，km）。為保證分析物的傳質(zhì)性不被限制，鍵合在生物傳感器表面的靶分子濃度必須較低。當(dāng)分析物被注入時(shí)，分析物-靶分子復(fù)合物在生物傳感器表面形成，導(dǎo)致反應(yīng)增強(qiáng)。而當(dāng)分析物被注入完畢后，分析物-靶分子復(fù)合物解離，導(dǎo)致反應(yīng)減弱。通過(guò)結(jié)合式相互作用模型擬合這種反應(yīng)曲線，動(dòng)力學(xué)常數(shù)便可被確定。而非特異性結(jié)合和總折射指數(shù)移相等效應(yīng)則可通過(guò)參照曲線減除功能予以驅(qū)除。


生物傳感器和微射流系統(tǒng)
SensiQ的SPR生物傳感器運(yùn)用了Texas Instruments公司研發(fā)的光學(xué)傳感器設(shè)計(jì)，以及Kretschmann SPR幾何學(xué)構(gòu)建，靈敏度高，光學(xué)靜穩(wěn)。生物傳感器一次性使用，其羧基化表面適合于多種優(yōu)化鍵合方案。生物傳感器的安裝快捷，幾秒鐘便可完成，使用也非常簡(jiǎn)便。功能化的生物傳感器即便在儲(chǔ)存一段時(shí)間后仍可繼續(xù)使用。
SensiQ的雙通道nL數(shù)量級(jí)的流動(dòng)池設(shè)計(jì)，利于實(shí)時(shí)的參照曲線減除，并保證分析物在生物傳感器的相互作用表面具有高傳質(zhì)性（Mass Transport）。最大地降低死體積和樣品散射,對(duì)于真實(shí)的和量化的動(dòng)力學(xué)和親和性數(shù)據(jù)的獲取至關(guān)重要。耐用的射流設(shè)計(jì)便于維修，明顯減少了停機(jī)時(shí)間。

表面等離子共振技術(shù)
表面等離子共振（SPR）是一種光學(xué)現(xiàn)象，可被用來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤在天然狀態(tài)下生物分子間的相互作用。這種方法對(duì)生物分子無(wú)任何損傷，且不需任何標(biāo)記物。

先將一種生物分子（靶分子）鍵合在生物傳感器表面，再將含有另一種能與靶分子產(chǎn)生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流經(jīng)生物傳感器表面。生物分子間的結(jié)合引起生物傳感器表面質(zhì)量的增加，導(dǎo)致折射指數(shù)按同樣的比例增強(qiáng)，生物分子間反應(yīng)的變化即被觀察到。這種反應(yīng)用反應(yīng)單位（RU）來(lái)衡量：1 RU = 1pg 蛋白/mm2 = 1 x 10-6 RIU（折射指數(shù)單位）。

分析物在被注入的過(guò)程中，由對(duì)流和擴(kuò)散流經(jīng)相互作用表面而與靶分子形成復(fù)合物，導(dǎo)致分析物濃度改變。微射流系統(tǒng)內(nèi)nL數(shù)量級(jí)流動(dòng)池的應(yīng)用，使得這種濃度的改變降至最低點(diǎn)，以確保高傳質(zhì)系數(shù)（Mass Transport Coefficient，km）。為保證分析物的傳質(zhì)性不被限制，鍵合在生物傳感器表面的靶分子濃度必須較低。當(dāng)分析物被注入時(shí)，分析物-靶分子復(fù)合物在生物傳感器表面形成，導(dǎo)致反應(yīng)增強(qiáng)。而當(dāng)分析物被注入完畢后，分析物-靶分子復(fù)合物解離，導(dǎo)致反應(yīng)減弱。通過(guò)結(jié)合式相互作用模型擬合這種反應(yīng)曲線，動(dòng)力學(xué)常數(shù)便可被確定。而非特異性結(jié)合和總折射指數(shù)移相等效應(yīng)則可通過(guò)參照曲線減除法予以驅(qū)除。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
親和分子對(duì)包括：
蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)（Protein–Protein） 
多肽–受體（Peptide–Receptor） 
抗體–抗原（Antibody–Antigen） 
膜受體–配體（Membrane Receptor–Ligand） 
凝集素–聚糖/糖蛋白（Lectin–Polysacharride/Glycoprotein） 
蛋白質(zhì)–小分子（Protein–Small Molecule） 
蛋白質(zhì)–核酸（Protein–Nucleic Acid） 
細(xì)胞–配體（Cell–Ligand）

任何一對(duì)親和分子，一個(gè)（靶分子）被鍵合在生物傳感器表面，另一個(gè)（分析物）被置于溶液中。當(dāng)含有分析物的溶液流經(jīng)靶分子鍵合的生物傳感器表面時(shí)，親和性復(fù)合物生成。

SensiQ配備雙通道流動(dòng)注射分析式微射流系統(tǒng)，內(nèi)有85nL流動(dòng)池。SensiQ使用一次性的SPR生物傳感器，裝卸簡(jiǎn)便。生物傳感器表面包被有單層的羧基化寡聚環(huán)氧乙烷（Carboxylated Oligoethyleneoxide）基質(zhì)，可鍵合多種生物分子，并有效地阻止非特異性結(jié)合及變性。靶生物分子的這種既被鍵合在固相生物傳感器表面，又存在于液相中的方式，增進(jìn)了兩種親和分子間的接觸性，同時(shí)避免了由于人為因素所造成的動(dòng)力學(xué)分析的復(fù)雜化。

SensiQ備有多種鍵合方案用于改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以支持生物分子的附著。最常用的偶聯(lián)方式是用EDC/NHS進(jìn)行胺偶聯(lián)。其它鍵合方式，例如順丁烯二酰亞胺-硫醇（Maleimide-thiol），還原胺化，酰肼-醛（Hydrazide-aldehyde），親和力捕獲等，亦可使用。SensiQ雙通道檢測(cè)中的一個(gè)通道可用于生成適當(dāng)?shù)膮⒄涨�線。當(dāng)表面化學(xué)物固定好以后，加入最多250 µl的樣品，緩沖液流經(jīng)生物傳感器表面時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定的基線。樣品注入和計(jì)時(shí)通過(guò)自動(dòng)化控制完成。通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)置向?qū)Чδ�，用戶可記錄多次注射周期，并具備高重�?fù)性。



控制軟件
SensiQ的控制軟件在原始反應(yīng)曲線生成時(shí)，同時(shí)并實(shí)時(shí)獲取和展示兩個(gè)通道內(nèi)的數(shù)據(jù)。參照通道內(nèi)的數(shù)據(jù)被減除，以補(bǔ)償熱漂移、非特異性結(jié)合、總折射指數(shù)移相等效應(yīng)，從而得到清晰高質(zhì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)�？刂栖浖�在反應(yīng)曲線上簡(jiǎn)單加入報(bào)告點(diǎn)，用來(lái)確定樣品注入后產(chǎn)生的結(jié)合反應(yīng)。報(bào)告點(diǎn)的添加可在實(shí)驗(yàn)中的任何時(shí)候由人工進(jìn)行，或由程序預(yù)設(shè)在固定的實(shí)驗(yàn)周期之中。列于表格中的所有報(bào)告點(diǎn)，連同相關(guān)的事件紀(jì)錄，均有案可查。數(shù)據(jù)文件被儲(chǔ)存后可被控制軟件重新打開(kāi)并編輯。


SensiQ控制軟件的簡(jiǎn)單明了的用戶界面，使得實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和進(jìn)行高效省時(shí)。實(shí)驗(yàn)向?qū)Чδ芎?jiǎn)化設(shè)置過(guò)程，提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

QDATTM分析軟件
反應(yīng)曲線的分析以及其后的動(dòng)力學(xué)和親和性數(shù)據(jù)測(cè)算通常繁瑣費(fèi)時(shí)。SensiQ的QDATTM分析軟件極大地簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)分析過(guò)程，為研究人員的動(dòng)力學(xué)和親和性測(cè)定提供了簡(jiǎn)單、省時(shí)、可信的手段。

QDATTM是在Biologic Software公司應(yīng)用廣泛的Clamp and Scrubber架構(gòu)之上開(kāi)發(fā)的最新一代分析軟件，可在幾分鐘內(nèi)成功分析采集到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。QDATTM的簡(jiǎn)明友好界面帶領(lǐng)用戶通過(guò)一系列步驟，幾秒鐘內(nèi)便完成信息的測(cè)算。QDATTM的模型擬合運(yùn)用數(shù)字整合及優(yōu)化的曲線擬合算法，迅速地估算最佳擬合參數(shù)值，確保相互作用模型和數(shù)據(jù)集的擬合，以測(cè)定動(dòng)力學(xué)和親和性常數(shù)，以及濃度分析。QDATTM同時(shí)提供了簡(jiǎn)單殘差圖和殘差標(biāo)準(zhǔn)差，用來(lái)定量評(píng)估擬合的程度。QDATTM的動(dòng)力學(xué)擬合模型包括準(zhǔn)一級(jí)結(jié)合模型（Pseudo-first-order Binding Model）和準(zhǔn)一級(jí)傳質(zhì)結(jié)合模型（Pseudo-first-order Binding Model with Mass Transport）。


技術(shù)參數(shù)
一次性生物傳感器是
流動(dòng)池?cái)?shù)量2
流動(dòng)池選擇1，或2，或1和2
流動(dòng)池面積2.2 mm2
流動(dòng)池容積85 nL（高傳質(zhì)率）
樣品加入手動(dòng)（注射器）
樣品注入自動(dòng)電腦控制人工電腦控制
樣品雙通道同時(shí)注入是
樣品注入體積10–250 μL
樣品注射泵內(nèi)置式外接式
樣品流動(dòng)速率5–150 μL /分自定（< 250 μL /分）
內(nèi)部死體積< 1.5 μL
實(shí)時(shí)參照曲線減除是
折射指數(shù)范圍1.32–1.401.33–1.40
短期背景噪音< 0.25 RU< 1 RU
長(zhǎng)期背景噪音< 0.30 RU/分（當(dāng)環(huán)境變化 < 3°C /小時(shí)）
溫度控制15–40°C室溫
尺寸（W x H x D）35.0 x 34.2 x 38.8 cm22.9 x 15.2 x 27.9 cm
重量15.9 kg3.6 kg
電源100–240 V，50/60 Hz
工作范圍
分子量低限< 200 Da< 250 Da
ka（結(jié)合速率常數(shù)） 1 x 107 M–1s–1
kd（解離速率常數(shù)）10–6–10–1 s–1
KD（kd / ka）10–4–10–10 M
濃度< 10–10–10–3 M

傳感器表面化學(xué)

胺基偶聯(lián)固定（COOH1和COOH2芯片）

由于胺基基團(tuán)的普遍性，所以通過(guò)胺基偶聯(lián)固定配體適用于絕大部分的生物分子。到目前我們發(fā)現(xiàn)這種方法將配體隨機(jī)固定，通常得到高質(zhì)量的結(jié)果。因此通過(guò)沒(méi)必要直接固定特定位點(diǎn)。
      最常用的方法是使用NHS和EDC含水混合物活化羧基產(chǎn)生胺基活性脂。這個(gè)流程有以下的幾個(gè)好處：
n        無(wú)需衍生作用，無(wú)需標(biāo)簽，可以固定絕大多數(shù)生物分子
n        產(chǎn)生大量穩(wěn)定的共價(jià)鍵，以防止配體從表面濾掉
n        在廣泛的pH值中是非常有效的
n        生物分子無(wú)需暴露在惡劣的條件中
n        很容易控制固定條件，可以防止與表面過(guò)度交叉連鎖
n        化學(xué)試劑制備，凍存數(shù)月



親和力捕獲表面組氨酸標(biāo)簽蛋白(HisCap和HisHiCap芯片) 

ICx Nomadics公司的HisCap芯片使聚組氨酸標(biāo)簽蛋白的固定穩(wěn)定、可逆，也讓表面等離子共振（SPR）實(shí)驗(yàn)更加簡(jiǎn)單。連有固定蛋白的基線非常穩(wěn)定，可以做動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)。
       HisCap芯片：
n        提供一個(gè)直接固定His-tagged蛋白的最便利的手段。
n        也可以適用于任何帶有足夠數(shù)量的組氨酸殘基的蛋白。
HisCap芯片采用Hoffman-LaRoche研發(fā)建立的NTA-Ni技術(shù)來(lái)附著蛋白質(zhì)。在這種技術(shù)中,感興趣蛋白質(zhì)的組氨酸的側(cè)鏈咪唑與表面附著的NTA-Ni復(fù)合物共協(xié)作，如圖所示。只要蛋白質(zhì)有足夠的組氨酸，這種技術(shù)就非常有效。典型的組氨酸標(biāo)簽是6個(gè)組氨酸，但是3個(gè)也可以。
HisCap芯片優(yōu)勢(shì)：
n        在實(shí)驗(yàn)室的重組蛋白工作中，His-tagging是一個(gè)長(zhǎng)期建立的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
n        利用HisCap芯片捕獲His-tagged蛋白產(chǎn)生穩(wěn)定的基線。
n        在溫和的條件,可以再生芯片。例如EDTA或者咪唑。
n        可重復(fù)使用HisCap芯片。


囊泡捕獲膜受體相互作用(VesCap芯片)

利用ICX囊泡捕獲（VesCap）芯片可以研究分子與細(xì)胞膜、脂質(zhì)體的相互作用，進(jìn)行實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)。在VesCap芯片中，脂雙層好像在自然細(xì)胞環(huán)境中，自身構(gòu)造中的各種細(xì)胞膜組分可以在細(xì)胞膜真實(shí)模型中自由混合。我們還不能確認(rèn)囊泡溶入單膜雙層，但是這在二維表面是極其可能。
n        一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛻?yīng)包含藥物、毒素以及在細(xì)胞信號(hào)中所涉及的周邊膜關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)
n        膜蛋白和伴生蛋白只在真實(shí)的細(xì)胞膜中相互作用
n        可以固定著床在脂質(zhì)體的受體/配體
VesCap芯片性質(zhì)：
n        脂雙層和膜蛋白的自身結(jié)構(gòu)依保持不變。在傳感器表面的囊泡捕獲是非共價(jià)的，允許任意方向上的膜組分自由融合。
n        PEG-正葵胺層展示出一個(gè)簡(jiǎn)單的二維相互作用平面。
n        附著在表面的囊泡、脂類體的制備很簡(jiǎn)單。
n        VesCap化學(xué)特別適合一個(gè)過(guò)度表達(dá)表面受體的細(xì)胞系
n        VesCap芯片的再生很簡(jiǎn)單。表面活化劑和溶劑的組合清除VesCap芯片表面所有的囊泡，從而再生VesCap芯片。


親和素-生物素固定(BioCap和AvCap芯片)

通過(guò)親和素-生物素為基礎(chǔ)的方法固定生物分子，操作簡(jiǎn)單、效果出色,在今天仍然廣受研究人員的歡迎。利用了這個(gè)技術(shù)，BioCap芯片和AvCap芯片可靠固定配體。示意圖如下描繪了這兩種固定方法。主要優(yōu)勢(shì)在于: 
n      不依賴于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)
n      只需要少量配體
n      可商業(yè)獲取，廣泛的生物素試劑
n        生物素試劑盒操作簡(jiǎn)單
n        固定只需要簡(jiǎn)單的注射
n      當(dāng)所需的Rmax達(dá)到時(shí)，停止注射可以精確的控制固定結(jié)合物的濃度
n      相對(duì)于COOH芯片，表面具有很低的靜電電荷
n      一個(gè)生物素反應(yīng)通常產(chǎn)生足夠產(chǎn)物，可以無(wú)限量的固定。