免疫學(xué)細(xì)胞因子的定量檢測(cè)，Elispot酶聯(lián)斑點(diǎn)分析技術(shù)

ELISPOT技術(shù)原理 
在免疫學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答（B細(xì)胞免疫），細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(cell mediated immune response，CMI)也是人們所關(guān)注的，而T細(xì)胞在CMI中起關(guān)鍵作用。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。 80 年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ ELISPOT ）。作為一項(xiàng)新型的免疫酶技術(shù)——酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞(ASC) 或分泌細(xì)胞因子(CK) 細(xì)胞的一項(xiàng)細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，易操作，成本相對(duì)流式細(xì)胞分析術(shù)也較低，已被廣泛用于分泌CK細(xì)胞檢測(cè)或ASC測(cè)定中，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。  
       ELISPOT 法源自 ELISA，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：  
       （1） ELISA通過(guò)顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。  
       （2） ELISPOT也是通過(guò)顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò)ELISPOT 分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）  
       由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬(wàn)-30萬(wàn)細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。  
       下面將從發(fā)展、原理、具體實(shí)驗(yàn)操作、技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用幾方面進(jìn)行介紹。 
ELISPOT技術(shù)的發(fā)展 
（1） ELISPOT技術(shù)的過(guò)去 
       ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky 等人率先在1983年，運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測(cè)出因受激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率。從那時(shí)起世界各國(guó)免疫學(xué)者便開(kāi)始一長(zhǎng)期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競(jìng)賽，每個(gè)團(tuán)隊(duì)都希望能率先將此一技術(shù)推廣來(lái)研究T細(xì)胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，藉由偵測(cè)T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子，來(lái)定量機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時(shí)預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進(jìn)行的下游免疫反應(yīng)。 
　　ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說(shuō)操作簡(jiǎn)單，但該技術(shù)并沒(méi)能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細(xì)胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細(xì)胞免疫走向T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生的第一個(gè)主要問(wèn)題，便是靈敏度的提升，因?yàn)門(mén)細(xì)胞因子較之B細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對(duì)抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個(gè)技術(shù)性的問(wèn)題，使當(dāng)時(shí)多數(shù)研究團(tuán)隊(duì)很難獲得清晰的斑點(diǎn)，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問(wèn)題直到1996美國(guó)俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn)PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點(diǎn)呈色問(wèn)題造成低敏感度的缺失。與原來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來(lái)吸附單株抗體，使T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子能在細(xì)胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點(diǎn)集中、清晰、對(duì)比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜（Panel B）并行實(shí)驗(yàn)的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過(guò)完全相同的實(shí)驗(yàn)，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點(diǎn)。  
　　第二個(gè)技術(shù)性問(wèn)題是ELISPOT Cytokine實(shí)驗(yàn)分析的幾個(gè)基本假設(shè)缺乏科學(xué)實(shí)證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時(shí)并沒(méi)受到該有的廣泛重視。沒(méi)有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問(wèn)題，諸如： 
    實(shí)驗(yàn)所得的斑點(diǎn)是抗原特定T細(xì)胞所生產(chǎn)，還是旁觀細(xì)胞受Cytokine刺激的次級(jí)效應(yīng)？  
    斑點(diǎn)的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？  
    能否相信斑點(diǎn)是由單一的細(xì)胞造成？ 
    ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測(cè)量的頻率范圍？ 
    如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時(shí)產(chǎn)生，它們是否會(huì)互相妨礙？及到什么程度？  
（2） ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在 
　　1996年以來(lái)隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達(dá)到科研人員的期待，它已是當(dāng)世公認(rèn)最靈敏抗原特定T細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)。藉由檢驗(yàn)新鮮分離PBMC細(xì)胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術(shù)可提示T細(xì)胞免疫系統(tǒng)的兩個(gè)重要參數(shù)：抗原特定T細(xì)胞的clone族群大�。缓兔庖咝�應(yīng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)路徑Th1/Th2。 
　　多年來(lái)經(jīng)過(guò)數(shù)十個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的致力研究，對(duì)于ELISPOT分析技術(shù)本身的幾個(gè)問(wèn)題，也有了科學(xué)上的驗(yàn)證。目前一般公認(rèn)，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細(xì)胞水平上識(shí)別抗原特定T細(xì)胞，主要針對(duì)經(jīng)由CD4或者CD8細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下，ELISPOT Cytokine 斑點(diǎn)的數(shù)量分析顯示斑點(diǎn)是由一個(gè)單細(xì)胞所生成，同時(shí)斑點(diǎn)形態(tài)學(xué)與Time Response分析則顯示斑點(diǎn)直徑大小直接反映該細(xì)胞族群的產(chǎn)能。也因?yàn)槿绱�，ELISPOT是個(gè)免疫學(xué)上的標(biāo)竿技術(shù)，它可以允許科研人員在幾乎自然生理?xiàng)l件下，觀察細(xì)胞實(shí)際分泌Cytokine的進(jìn)程，進(jìn)而可以得到藥理學(xué)信息，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細(xì)胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細(xì)胞免疫一般可通過(guò)兩程截然不同的機(jī)轉(zhuǎn)；使能分泌Cytokine的Precursor T細(xì)胞族群變小，或減少每Precursor T細(xì)胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息。 
　　ELISPOT分析技術(shù)的幾個(gè)特點(diǎn)已經(jīng)讓它在抗原特定T細(xì)胞免疫學(xué)上獨(dú)占鰲頭。此技術(shù)是當(dāng)世唯一準(zhǔn)許百萬(wàn)分之一1:1000,000的準(zhǔn)確分析，如此強(qiáng)效的解析力使流式細(xì)胞技術(shù)也望其項(xiàng)背，以目前國(guó)內(nèi)外常規(guī)的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對(duì)T細(xì)胞免疫學(xué)研究是必須的，因?yàn)榭乖�特定T細(xì)胞一般在機(jī)體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬(wàn)中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實(shí)適用于冰凍后復(fù)蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當(dāng)?shù)男�價(jià)，沒(méi)有喪失功能。這一點(diǎn)對(duì)臨床試驗(yàn)非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗(yàn)牽涉全國(guó)多個(gè)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，病人血樣可冰存并同時(shí)集中在「中央實(shí)驗(yàn)室」一齊被測(cè)試。同理，一個(gè)血樣或標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品可被分裝小份，被送到不同檢驗(yàn)中心進(jìn)行測(cè)試，以交互比對(duì)，同時(shí)有利ELISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。 
（3） ELISPOT 未來(lái)展望 
　　ELISPOT 分析技術(shù)正在歐美各國(guó)發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學(xué)家可以直接洞察活體內(nèi)T細(xì)胞相關(guān)生理學(xué)或病理學(xué)，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng)由這個(gè)技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進(jìn)入一個(gè)器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到全新的智識(shí)。 
　　從各國(guó)文獻(xiàn)可見(jiàn)ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應(yīng)用在多項(xiàng)領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時(shí)的反應(yīng)(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫病人體內(nèi)的一個(gè)特定的免疫反應(yīng)型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術(shù)同時(shí)也在數(shù)個(gè)疫苗效價(jià)評(píng)估人體試驗(yàn)中，被當(dāng)成重要的終結(jié)指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過(guò)與大陸北京性艾中心合作，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計(jì)劃將是首次利用ELISPOT技術(shù)對(duì)亞洲國(guó)家從事HIV疫苗研究和臨床試驗(yàn)的有關(guān)研究。我們期待未來(lái)此技術(shù)能在我國(guó)免疫學(xué)界得到廣泛地應(yīng)用。  

原理 
       ELISPOT就其原理來(lái)說(shuō)實(shí)在是很簡(jiǎn)單的，從本質(zhì)上說(shuō)和ELISA的原理是一樣的，理解起來(lái)并不難。細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過(guò)ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。傳統(tǒng)的ELISA與ELISPOT都是根據(jù)酶免疫學(xué)檢測(cè)原理，通過(guò)酶的高催化頻率，放大反應(yīng)效果，從而達(dá)到很高敏感度的檢測(cè)效果。 
　　ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在96微孔培養(yǎng)盤(pán)底部披覆PVDF薄膜，用來(lái)吸附特殊挑選、且無(wú)毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會(huì)被分配到微孔盤(pán)上，再接受適當(dāng)?shù)目乖�刺激，并將微孔盤(pán)放置于溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)一段時(shí)間。一般而言，記憶型T細(xì)胞在受抗原刺激數(shù)小時(shí)后會(huì)開(kāi)始分泌細(xì)胞激素，此時(shí)局部(在緊靠分泌細(xì)胞的周圍)分泌出的細(xì)胞激素會(huì)被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤(pán)中的細(xì)胞被移除并清洗后，被捕獲的細(xì)胞激素可進(jìn)一步使用生物素（Biotin）標(biāo)記的二次抗體來(lái)標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會(huì)留下染色斑點(diǎn)。 
反應(yīng)步驟可大致分為： 
       （1） 利用特定細(xì)胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點(diǎn)； 
       （2） 加入細(xì)胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子會(huì)往附近擴(kuò)散與之前包被的抗體進(jìn)行特異結(jié)合； 
       （3） 洗掉細(xì)胞； 
       （4） 加入酶標(biāo)二抗特異與細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)底物的顯色反應(yīng)，一個(gè)細(xì)胞所在位置就會(huì)顯出斑點(diǎn)，最后利用顯微鏡或者特定的讀板機(jī)（reader）就可以計(jì)算出樣品中被激活細(xì)胞的數(shù)目。 
       以上是檢測(cè)分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的流程，如果是檢測(cè)分泌特異抗體的細(xì)胞只需把包被特異抗體變?yōu)榘�被特異抗原即可�?nbsp;
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ELISPOT技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟 
    從原理上看ELISPOT的確很簡(jiǎn)單，但是在操作過(guò)程中有許多條件需要摸索，所以這里進(jìn)一步介紹一下ELISPOT的操作步驟。 
    （1） 將適量捕獲性抗體預(yù)先包被于96孔ELISPOT板上，用膠帶封板并在4℃孵育過(guò)夜。將板用PBS洗6遍，再用含體積比10%胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基封閉，室溫下孵育至少1h。FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng)。有一種特殊的96孔板底面介質(zhì)是PVDF膜，利用膜的多孔結(jié)構(gòu)可以讓單個(gè)細(xì)胞坐到其中，然后分泌細(xì)胞因子或特定抗體，這樣使最后的檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞靈敏度成為可能。同時(shí)，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT與ELISA的不同之處。理論上是可以同時(shí)包被兩個(gè)不同的抗體的，兩種不同的抗體可以利用不同的顯色系統(tǒng)顯出不同顏色，但是這樣就要考慮到不同抗體間的不親和性，必需保證每種抗體包被的數(shù)量要足夠。如果是使用試劑盒的預(yù)包被板，這一步就可以省略啦。 
    （2） 將陰性對(duì)照和細(xì)胞樣品，如外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經(jīng)純化的CD8+T細(xì)胞或去除某種特異細(xì)胞群的PBMC，用含10%FCS的培養(yǎng)基稀釋至5×104～2×105個(gè)/孔如果條件可以達(dá)到更高的細(xì)胞數(shù)，建議可以嘗試3×105～5×105個(gè)/孔，特別是在分泌細(xì)胞），分裝于ELISPOT板孔中，再加入特異的刺激物，如多肽或基因表達(dá)產(chǎn)物，提取的抗原等，陰性對(duì)照孔中只加入培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)中最好采用無(wú)血清的培養(yǎng)基，這樣可以避免因?yàn)檠�清批次不同的差異所造成的誤差，同時(shí)也避免血清的某些成份會(huì)引起非特異的反應(yīng)），陽(yáng)性對(duì)照孔加入植物血凝素(PHA，2μg/mL)或陽(yáng)性多肽，37℃，體積比為5% CO2培養(yǎng)24～48h。要進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞必需制備成為懸液的形式。利用ELISPOT的檢測(cè)是十分靈敏的，頻率低至10-12的分泌細(xì)胞都可以被檢測(cè)出來(lái)。并且對(duì)于那些會(huì)貼壁的細(xì)胞也可以使用此種方法，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后不易被洗去，但是不會(huì)妨礙最后斑點(diǎn)的顯色。只要細(xì)胞可以正常分泌與抗體特異結(jié)合的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會(huì)逐步擴(kuò)散到細(xì)胞四周，最后還是可以顯示出斑點(diǎn)。 
    （3） 用含體積比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以棄去細(xì)胞，加入生物素化抗細(xì)胞因子的檢測(cè)抗體，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP標(biāo)記的鏈親和素，室溫孵育3h。 
    （4） 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物 室溫下顯色，待出現(xiàn)紫色(AKP和底物的產(chǎn)物)或紅色(HRP和底物的產(chǎn)物)斑點(diǎn)時(shí)，即可用立體解剖顯微鏡或計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)，并用斑點(diǎn)形成單位(sfu/L百萬(wàn)加入細(xì)胞)記錄結(jié)果。每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)特異分泌CK的細(xì)胞。若預(yù)先包被抗原，則可用于ASC測(cè)定，這時(shí)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌特異抗體的細(xì)胞。 
    完成了以上步驟后其實(shí)只是完成了實(shí)驗(yàn)的一半。在你不斷摸索反應(yīng)的條件之后，得到了一塊布滿斑點(diǎn)的板，接下來(lái)要如何對(duì)這些斑點(diǎn)進(jìn)行分析呢。如果利用顯微鏡人工技術(shù)無(wú)疑是太參有個(gè)人因素的實(shí)驗(yàn)了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果肯定會(huì)被審稿人好好質(zhì)疑一番。隨后，有人使用數(shù)碼相機(jī)拍攝下來(lái)后，使用photoshop進(jìn)行處理、計(jì)數(shù)，這種方法也存在較多的個(gè)人因素。一項(xiàng)技術(shù)要普及，為廣大研究人員所接受，就必需盡量減小人為的誤差。所以，近年許多公司開(kāi)始開(kāi)發(fā)計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)，使用系統(tǒng)設(shè)定的閾值對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行人工智能計(jì)數(shù)。這樣，由計(jì)算機(jī)將陰性對(duì)照中非特異反應(yīng)斑點(diǎn)進(jìn)行去除，同時(shí)由計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)一計(jì)數(shù)，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果置信度便大大提升了。目前判斷的首要標(biāo)準(zhǔn)還是斑點(diǎn)的大小，但是做過(guò)電泳、同位素等的計(jì)算機(jī)成像的研究人員都遇到過(guò)一個(gè)問(wèn)題：很多時(shí)候?qū)嶒?yàn)會(huì)產(chǎn)生一些較淡的斑點(diǎn)，用肉眼判斷絕對(duì)是背景。所以在設(shè)計(jì)軟件時(shí)也必需考慮到斑點(diǎn)深淺因素。計(jì)算機(jī)可以利用斑點(diǎn)的深淺、是否以中心為原點(diǎn)向四周減淡等特征對(duì)細(xì)胞分泌動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，這項(xiàng)技術(shù)的成熟相信會(huì)使ELISPOT的應(yīng)用范圍更加擴(kuò)寬。 
   （5） ELISPOT 斑點(diǎn)的判讀像多數(shù)的Cell-based分析技術(shù)一樣，ELISPOT Cytokine技術(shù)也是相當(dāng)耗時(shí)、耗勞力的工作。事實(shí)上到目前為止，以目視法判讀少量細(xì)胞族群的特性如激活T細(xì)胞之激素分泌，仍被視為是免疫學(xué)技術(shù)上的一大挑戰(zhàn)。ELISPOT結(jié)果的判讀常需要專聘、有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)員才可以；有時(shí)就算有專職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)仍不免會(huì)偶有主觀意見(jiàn)，而有所偏頗。 
    科學(xué)實(shí)證的本質(zhì)，在于如何使實(shí)驗(yàn)結(jié)果能盡可能客觀、精確、同時(shí)有高重現(xiàn)性，傳統(tǒng)的人工計(jì)算法顯然無(wú)法達(dá)到此一要求。故而有幾個(gè)科研團(tuán)隊(duì)使自行開(kāi)發(fā)Plate Scanner與自動(dòng)分析軟件，其中以Paul Lehmann教授研究開(kāi)發(fā)之ImmunoSpot Analyzer自動(dòng)分析儀最具代表性。分析ELISPOT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的過(guò)程中，儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲(chǔ)存成TIF檔；這些影像可以進(jìn)一步使用手動(dòng)、或是自動(dòng)方式計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)目，如果使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設(shè)定條件，然后同時(shí)分析斑點(diǎn)的大小，以推估激素分泌的多寡。預(yù)料像ImmunoSpot Analyzer這一類自動(dòng)圖像掃描分析儀器，將可克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費(fèi)人力、及人為客觀性等缺點(diǎn)，徹底解除ELISPOT分析技術(shù)的瓶頸問(wèn)題，進(jìn)一步推廣該技術(shù)的新穎應(yīng)用。 
    ImmunoSpot@影像掃描分析儀可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過(guò)的膜表面影像、每個(gè)小孔中的斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中的平均斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中斑點(diǎn)大小的直方統(tǒng)計(jì)圖。 

ELISPOT分析儀的出現(xiàn)解決了以下問(wèn)題 
    哪些斑點(diǎn)是抗原特異性 T 細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)具有進(jìn)一步分析價(jià)值），哪些是無(wú)關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)沒(méi)有 T 細(xì)胞研究?jī)r(jià)值）  
    斑點(diǎn)大小的意義 。 
    在對(duì)不同細(xì)胞因子計(jì)數(shù)和分析時(shí)，如何定義斑點(diǎn)最大和最小尺寸。 
    如何從單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上分析 。 
    實(shí)驗(yàn)精確度有多高？如果一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子，在多大程度上會(huì)干擾分析結(jié)果。 
    幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能使結(jié)果更有意義。 

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ELISPOT技術(shù)優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用 
     ELISPOT的歷史可以追溯到1963年Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)(hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF)，這項(xiàng)技術(shù)可用于檢測(cè)并計(jì)數(shù)單個(gè)抗體形成細(xì)胞。隨著單克隆抗體技術(shù)的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法檢測(cè)脾細(xì)胞中分泌特異性抗體的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)該方法敏感性高簡(jiǎn)便易行。后來(lái)，他們又用這種方法定量分析受到有絲分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的細(xì)胞數(shù)。隨后，用ELISPOT法在單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌其他細(xì)胞因子(如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6) 數(shù)量的手段也被建立起來(lái)。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來(lái)提高這種方法的敏感性，Herr用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assisted video image analysis，CVIA)自動(dòng)分析TNF2α酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的大小和數(shù)量，計(jì)算與負(fù)載抗原肽的靶細(xì)胞接觸后外周血單核細(xì)胞(PBMC)中抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，不但提高了對(duì)背景染色的分辨力也使大規(guī)模研究成為可能。Vaquerano等將數(shù)碼相機(jī)和計(jì)算機(jī)結(jié)合起來(lái)，開(kāi)發(fā)出類似的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)系統(tǒng)，認(rèn)為當(dāng)每孔斑點(diǎn)數(shù)大于100時(shí)，這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時(shí)間。 
       隨著ELISPOT技術(shù)的不斷發(fā)展，它的優(yōu)勢(shì)也漸漸顯示出來(lái)，下面將列舉ELISPOT對(duì)比其它一些傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)所在。 
       ELISPOT 分析使單細(xì)胞分泌產(chǎn)物可視化。這些分析異常敏感，因?yàn)樗�是在直接在分泌�?xì)胞的周圍進(jìn)行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細(xì)胞上的受體捕獲，或降解之前。最低至1：100萬(wàn)細(xì)胞精度的活體外頻率測(cè)量。這種分辨率已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)使用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的四聚物染色和ELISA法測(cè)量的精度。這種高敏感度是非常關(guān)鍵的，因?yàn)榭乖�特異�?nbsp;T 細(xì)胞在體外都是典型性的低頻率。高產(chǎn)量T細(xì)胞分析成為可行。一個(gè)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室小組可以測(cè)試成百的樣本中幾十種抗原的反應(yīng)。只需要少量細(xì)胞，就可以用于通其他細(xì)胞學(xué)分析方法進(jìn)行比較。例如，45毫升的血液就足以用于測(cè)試600種不同抗原/肽類物質(zhì)的反應(yīng)。可以定義CD4和CD8細(xì)胞的免疫因子指標(biāo)。這是因?yàn)橹恍枰�少�?shù)細(xì)胞，分析就可以在高產(chǎn)量模式下進(jìn)行。ELISPOT分析在篩選肽庫(kù)，繪制免疫因子方面是一個(gè)理想的工具。 用于確定抗原特異性T細(xì)胞的功能性親和力。這最大可能受到肽類藥物刺激至50%的影響�？梢杂糜谘芯课唇�(jīng)藥物處理過(guò)的細(xì)胞的分泌過(guò)程。如果觀察到凈產(chǎn)量減少，可以確定這種區(qū)別是來(lái)自分泌細(xì)胞的減少，還是每個(gè)細(xì)胞分泌產(chǎn)量的減少。淋巴細(xì)胞在ELISPOT分析后依然存活。這使得分析之后進(jìn)行增值，用于更進(jìn)一步的分析、克隆或者低溫儲(chǔ)藏成為可能低溫儲(chǔ)藏后的人類淋巴細(xì)胞可以用于檢測(cè)，而不會(huì)丟失其功能。治療前和治療后的樣本可以并排進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果可以重復(fù)。 
（1） 與ELISA 
       ELISA 通過(guò)顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT 也是通過(guò)顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)， 1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬(wàn)-30萬(wàn)細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。  
與有限稀釋法（limiting dilution analysis，LDA） 
       LDA能夠?qū)μ禺愋訡TL細(xì)胞進(jìn)行定量，曾在很多年中被認(rèn)為是CTL 檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它使人們能夠詳細(xì)了解免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和記憶毒性T淋巴細(xì)胞(memorial CTL， mCTL) 亞群的細(xì)胞周期。但該方法需要高強(qiáng)度抗原刺激， 這會(huì)加快效應(yīng)CTL(eCTL)凋亡，且不能定量測(cè)定eCTL細(xì)胞數(shù)量或測(cè)定值偏低。其次，該方法較繁瑣，培養(yǎng)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)2～3周，而且很容易造成T細(xì)胞數(shù)量損失。 
（2） 與四聚體法（Tetramer） 
       最近幾年出現(xiàn)了MHC2Ⅰ類分子抗原肽四聚體法。該法的優(yōu)勢(shì)在于迅速、直接、靈敏且特異性強(qiáng)，即使當(dāng)體內(nèi)mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測(cè)到準(zhǔn)確的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但該技術(shù)也存在較多應(yīng)用上的困難：除了合成及穩(wěn)定MHCⅠ類分子的技術(shù)困難外，最主要缺點(diǎn)是表位的選擇。由于每次反應(yīng)只能分析單一的抗原表位，而MHCⅠ類分子結(jié)合的各種表位，能否形成CTL反應(yīng)，卻隨著基因背景及時(shí)間的變化而變化，因此選擇正確的表位就顯得尤為重要。優(yōu)勢(shì)表位的篩選可以通過(guò)Elispot 來(lái)進(jìn)行，但對(duì)整個(gè)肽庫(kù)進(jìn)行掃描，并不是一件很容易的事。當(dāng)然，生物信息學(xué)的運(yùn)用對(duì)表位的篩選有很大的幫助。同時(shí)，有研究結(jié)果表明，并非所有經(jīng)過(guò)Tetramer 鑒定的陽(yáng)性細(xì)胞都有確切的功能， Tetramer陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)是用ELISPOT分析能分泌INF2γ細(xì)胞數(shù)的10倍，其中很多是不表現(xiàn)功能的惰性細(xì)胞，可能代表了記憶型CTL前體細(xì)胞。Tetramer分析只增加了分析的靈敏度，同時(shí)測(cè)定其功能很重要。 
（3） 與Cr51釋放法 
       此法是一種比較經(jīng)典的方法，雖然在檢測(cè)CTL識(shí)別的抗原多樣性方面非常有效，且能精確闡明被CTL識(shí)別的最佳表位，但至多為半定量的層面，而且Cr51標(biāo)記細(xì)胞的自發(fā)釋放率較高，不適于較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)；標(biāo)記時(shí)所需的細(xì)胞濃度較高，因而給試驗(yàn)帶來(lái)諸多不便；此外，Cr51釋放法所測(cè)定的是一個(gè)細(xì)胞群體的特性，而不是單個(gè)細(xì)胞。 
（4） 與胞內(nèi)CK染色法 
       與ELISPOT法相比較，胞內(nèi)CK染色法(intra-cellular CK staining，ICS) 主要應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)累積細(xì)胞因子的染色和多色參數(shù)的FACS法，是檢測(cè)循環(huán)淋巴細(xì)胞中抗原特異性T 淋巴細(xì)胞的可行方法，而ELISPOT法卻可以檢測(cè)所有分泌CK的eCTL 。 

應(yīng)用 
       目前，ELISPOT已被用于檢測(cè)藥物、化學(xué)制劑及其它CK復(fù)合物的特性及功能等方面，因此為體內(nèi)免疫功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)提供了檢測(cè)依據(jù)。近幾年來(lái)， ELISPOT技術(shù)在腫瘤疫苗評(píng)價(jià)試驗(yàn)、免疫監(jiān)測(cè)及免疫學(xué)研究中越來(lái)越被廣泛地使用。 

（1） 在抗腫瘤免疫及相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用 
      在許多研究中，該技術(shù)已被用于免疫動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞中抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的數(shù)量檢測(cè)。近期，ELISPOT技術(shù)已用于分析和評(píng)價(jià)從傳染病病人的PBMC中檢測(cè)肽特異的T淋巴細(xì)胞以及在癌癥病人中誘導(dǎo)腫瘤特異的T細(xì)胞的疫苗試驗(yàn)。 
ELISPOT檢測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)時(shí)敏感性、特異性和可重復(fù)性都很高，操作簡(jiǎn)單迅速，需要少量標(biāo)本，在檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)也反應(yīng)其功能，并與臨床結(jié)果相關(guān)。ELISPOT平板可以提前大量準(zhǔn)備，移液、洗板和讀板都可自動(dòng)化，因而大批量檢查也可做到快速高效。在與與其他方法的比較后，ELISPOT很可能成為定量分析腫瘤或病毒特異性的T細(xì)胞反應(yīng)的首選。 
（2） 在抗感染免疫中的應(yīng)用 
       CTL在抗病毒感染的免疫應(yīng)答中占有主要地位，而CD4+輔助性T細(xì)胞亞群Th1/Th2的平衡在抵御病毒感染中起著同樣重要的作用。在HIV研究方面，由MHC-1類分子加工的不同抗原經(jīng)CTL識(shí)別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答在控制HIV-1感染中同樣起重要作用。利用ELISPOT方法檢測(cè)CK如IFN2γ就可以進(jìn)一步了解到針對(duì)HIV特異的CTL應(yīng)答及相關(guān)免疫信息。 
       此外，ELISPOT法還用于評(píng)價(jià)由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及HIVgp 120g與霍亂毒素共表達(dá)的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中，ELISPOT還用來(lái)檢測(cè)通過(guò)直腸免疫低劑量甲肝疫苗而產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在急性的自限性肝炎中，以Th1為主的應(yīng)答促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，且在控制病毒感染及延緩慢性疾病的發(fā)展方面有重要作用。 
       在許多抗細(xì)菌免疫研究中，該方法也發(fā)揮了重要作用。例如：應(yīng)用ELISPOT試驗(yàn)證實(shí)表達(dá)大腸桿菌MalE蛋白的重組卡介苗(rBCG.MalE)誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答是CD4+T細(xì)胞依賴的，rBCG.MalE 誘導(dǎo)的特異CD4+T細(xì)胞應(yīng)答存在Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，并逐步形成Th1/ Th2 混合應(yīng)答。 
（3） 臨床方面 
       目前，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)臨床檢驗(yàn)的領(lǐng)域是對(duì)肺結(jié)核（TB）的檢測(cè)。而最近的研究熱點(diǎn)就是對(duì)于移植的預(yù)測(cè)。受體對(duì)供體特異性HLA抗體一直以來(lái)都是器官移植的一大障礙，因?yàn)樗鼈兊拇嬖诓粌H介導(dǎo)超急性排斥反應(yīng)而且還可導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)。因此，HLA抗體的存在限制了異體抗原敏感患者對(duì)供體器官的需要，因而增加了等待移植的時(shí)間。在心臟，肝臟和腎臟異體移植后早期出現(xiàn)的并發(fā)癥如急性排斥反應(yīng)與移植前存在的異體免疫臨床相關(guān)性迫切需要一種恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法在器官移植前能了解受體對(duì)供體特異性體液免疫的功能狀態(tài)。 
    在接受移植的人群中，部分因有多次輸血、或既往有異體移植失敗或多次妊娠史體內(nèi)曾經(jīng)存在陽(yáng)性異體抗體，在他們接受異體移植時(shí)，現(xiàn)有的檢測(cè)方法只能顯示他們對(duì)異體的免疫功能正常。但他們體內(nèi)存在記憶B淋巴細(xì)胞，一旦受到相應(yīng)HLA 抗原的刺激則會(huì)喚起免疫反應(yīng)，這不僅影響著移植的結(jié)果，甚至?xí)�出現(xiàn)危及患者生命的、與移植相關(guān)的并發(fā)癥。 
    ELISPOT是一種強(qiáng)有效的檢測(cè)單個(gè)抗體分泌細(xì)胞的方法，具有很高的敏感性。因此，刺激記憶B淋巴細(xì)胞增殖、分化成漿細(xì)胞，并建立一種特異性ELISPOT方法檢測(cè)HLA抗體產(chǎn)生細(xì)胞是最佳手段。 如果ELISPOT要進(jìn)一步推廣應(yīng)用，特別是臨床應(yīng)用，其標(biāo)準(zhǔn)化將是一個(gè)十分重要的問(wèn)題。美國(guó)FDA和NIH等已經(jīng)開(kāi)始建立ELISPOT的標(biāo)準(zhǔn)化流程，相信隨著ELISPOT技術(shù)的成熟、標(biāo)準(zhǔn)化程序的建立，它的應(yīng)用將更加廣泛。 



ELISPOT 實(shí)驗(yàn)方案 

對(duì)應(yīng)BD的試劑盒 
實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備 
試劑盒中沒(méi)有但是必須的 
材料:   
• 已消毒的移液器 (Gilson)。單道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul 
• 無(wú)菌一次性聚苯乙烯吸量管 (1ml, 5ml, 10ml）(Axygen)。 
• 一次性乳膠手套 。 
• 無(wú)菌一次性離心管（15ml、50ml）(Corning cat#430052 and 430290)。 
• 吸水紙(衛(wèi)生紙) 
• 無(wú)菌tip頭, 200ul,1ml, 

    試劑: 
1.        PBS 無(wú)菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在準(zhǔn)備包被抗體時(shí)不要使用商業(yè)化的PBS 
2.        ddH2O(無(wú)菌) 對(duì)于10塊ELISPOT板，200 ml 
3.        有菌洗滌緩沖液(PBST)：有菌3000ml/10板 
Tween-20 進(jìn)口 
4.        有菌洗滌緩沖液(PBS)：有菌1000ml/10板 
5.        培養(yǎng)液：無(wú)血清培養(yǎng)基 （P/S, 2 mM 的谷氨酰胺，以及 Hepes buffer）。 
6.         PMA ＋ionomycin. 
    Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended). 
PMA  
貯 存 液：PMA溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存 
工 作 液：貯存液 1:4000稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中 
此時(shí)為 250ng/ml  
 Calcium ionophore (ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended). 
Ionomycin  
貯 存 液：Ionomycin溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存 
工 作 液：貯存液 1:200稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基中 
此時(shí)為 5μg/ml  
50ml混合刺激劑＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)齊 


7.        10% 熱滅活胎牛血清 (Hyclone cat# ALH14384 ) 
8.        抗原 
      
設(shè)備: 
• 洗板器: 自動(dòng)或手動(dòng) (洗瓶, 手動(dòng)分液器等)。 
•專用CO2-細(xì)胞培養(yǎng)箱 (37°C)。 
4°C冰箱 
無(wú)菌間無(wú)菌操作臺(tái) 



Preparation kit reagents   
1．包被用抗體 
取50 μl加到10ml PBS中。（足夠包被1塊96孔板，100 μl/well）。 
對(duì)10塊板子， 500ul加到100ml PBS中 
2．生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體（detector antibody） 
取50μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/well）。 
對(duì)10塊板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer(PBS+10%FBS) 
3．STREP-HRP 
取100μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。 
對(duì)10塊板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer 

4 顯色激活系統(tǒng)（Activation system） 
對(duì)于1塊ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，10分鐘內(nèi)用完。（100 μl/孔）。 

ELSPOT實(shí)驗(yàn)步驟 
Day 1  
包被ELISPOT板 16：30 

1.        在ELISPOT板中每孔加入包被抗體100μl，4℃ 過(guò)夜。 
Day 2 
ELISPOT板的封閉  17：00 

2.        取出已包被的ELISPOT板，吸棄每孔中的包被抗體溶液。 
3.        用完全無(wú)血清培養(yǎng)基洗1次。 
4.        在ELISPOT板中，每孔加入200μl完全無(wú)血清培養(yǎng)基。室溫2h。(8道排槍) 
5.          
PBMC加入ELISPOT培養(yǎng)板 20：00 

6.        取出封閉2h的ELISPOT板，吸棄每孔中的封閉液。(不要洗板！) 
7.        在ELISPOT板中，先加30μl 無(wú)血清培養(yǎng)基(12道排槍)和20μl肽庫(kù)(8道排槍)，后加50μl細(xì)胞(8道排槍) (每孔活細(xì)胞總數(shù)為2×105，每個(gè)病人需活細(xì)胞總數(shù)為10×106，體積為2.5 ml。每條多肽的終濃度為5μg/ml，活細(xì)胞的工作濃度為4×106/ml，活細(xì)胞的終濃度為2×106/ml）。 
陽(yáng)性孔中每孔加入50μl 細(xì)胞和30μl無(wú)血清培養(yǎng)基和20μl PMA+Inomysin（工作液濃度分別為250ng/ml和5ug/ml，終濃度分別為50ng/ml和1ug/ml）。 
8.        用low evaporation lid 蓋好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)30 h。 
注意：不要晃動(dòng)ELISPOT板。 

Env1	Env1	Pol1	Pol1	Vif	Vif	Env1	Env1	Pol1	Pol1	Vif	Vif
Env2	Env2	Pol2	Pol2	陰對(duì)	陰對(duì)	Env2	Env2	Pol2	Pol2	陰對(duì)	陰對(duì)
樣本 1 Env3	Env3	Pol3	Pol3	陰對(duì)	陰對(duì)	樣本2 Env3	Env3	Pol3	Pol3	陰對(duì)	陰對(duì)
Env4	Env4	Pol4	Pol4	陰對(duì)	陰對(duì)	Env4	Env4	Pol4	Pol4	陰對(duì)	陰對(duì)
Env5	Env5	Pol5	Pol5	陰對(duì)	陰對(duì)	Env5	Env5	Pol5	Pol5	陰對(duì)	陰對(duì)
Gag1	Gag1	Nef	Nef	陰對(duì)	陰對(duì)	Gag1	Gag1	Nef	Nef	陰對(duì)	陰對(duì)
Gag2	Gag2	Tat REV	Tat REV	樣本陽(yáng)對(duì)	樣本陽(yáng)對(duì)	Gag2	Gag2	Tat REV	Tat REV	樣本陽(yáng)對(duì)	樣本陽(yáng)對(duì)
Gag3	Gag3	Vpu Vpr	Vpu Vpr	樣本陽(yáng)對(duì)	樣本陽(yáng)對(duì)	Gag3	Gag3	Vpu Vpr	Vpu Vpr	樣本陽(yáng)對(duì)	樣本陽(yáng)對(duì)

Day 4  
二抗和GABA標(biāo)記，顯色反應(yīng) 8：30 
9.        培養(yǎng)30h后，取出ELISPOT板，甩去細(xì)胞后。 
10.    用去離子水洗滌2次。每次浸泡5分鐘。 
11.    用0.05％PBST洗滌3次。每次浸泡2分鐘。 
12.    每孔加入100μl 生物素化的detector Ab(8道排槍)。室溫2小時(shí)。 
13.    取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗滌3次。每次浸泡2分鐘 
每孔加入100μl Strep-HRP溶液(8道排槍)。室溫1小時(shí) 
14.    取出ELISPOT板，倒去Strep-HRP溶液。 
15.    PBST洗滌4次。每次浸泡2分鐘。 
16.    用PBS洗滌2次。每次浸泡2分鐘。 
17.    洗滌完畢后，在吸水紙上輕輕拍干ELISPOT板。 
每塊板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，15分鐘內(nèi)用完。 
18.    每孔加入100 µl 配好的substrate(8道排槍)。在暗處、室溫下孵育（5～60分鐘）。 
出現(xiàn)斑點(diǎn)后，用自來(lái)水沖洗，中止反應(yīng)。室溫下干燥，檢測(cè)。