ACQUITY UPLC-TUV測定奶粉和牛奶中三種牛乳清蛋白的含量
ACQUITY UPLC-TUV測定奶粉和牛奶中三種牛乳清蛋白的含量
趙淑軍
沃特世科技（上海）有限公司
摘要：一種α-牛乳清蛋白和兩種β-牛乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)分別用超純水稀釋配制，采用ACQUITY UPLC BEH300 C18色譜柱分離，ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色譜檢測。Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三種乳清蛋白可達基線分離，線性范圍為1.000-100.000mg/kg，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2_0.999，方法的檢出限為1.000 mg/kg。
關(guān)鍵詞：超高效液相色譜 奶粉 牛奶 牛乳清蛋白 Bα-La Bβb-Lg Bβa-Lg
前言
乳清蛋白是牛奶中的主要蛋白質(zhì)，乳清蛋白主要包括α-牛乳白蛋白（Bα-Lactalbumin，Bα-La）、β-牛乳球蛋白（Bβ-Lactoglbulin，Bβ-Lg）、蛋白酶-胨和牛血清白蛋白等，前兩者是乳清蛋白的主要成分，分別占其總量的10-20%和40-50%，β-牛乳球蛋白包括Bβb-Lg和Bβa-Lg兩個遺傳變異體。[1-2]
乳清蛋白具有營養(yǎng)價值高、易消化吸收、含有多種活性成分等特點，已經(jīng)被越來越多地應(yīng)用于食品工業(yè)，市場上同時出現(xiàn)了不同種類和品牌的乳清蛋白保健品，如兒童營養(yǎng)蛋白粉、嬰兒配方奶粉等[3]。但有報道乳清蛋白又是一種常見的過敏原，β-乳球蛋白是最主要的過敏原，α-乳白蛋白緊隨其后[4]。UPLC以其1.7μm超細填料色譜柱和15000psi的超高效液相色譜系統(tǒng)，可以完美實現(xiàn)Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三種乳清蛋白分離；尤其對于Bβb-Lg和Bβa-Lg兩個遺傳變異體可實現(xiàn)完全分離。以及配備高靈敏度Waters ACQUITY TUV紫外檢測器，整個系統(tǒng)檢測三種乳清蛋白檢出限達到1ppm。該檢測方法可應(yīng)用于牛奶或奶粉中α-牛乳白蛋白和β-牛乳球蛋白的定量檢測。
實驗方法
材料、試劑和儀器
乙腈為色譜純，三氟乙酸為優(yōu)級純，Triton X-100，氯化鈉（優(yōu)級純），實驗用水為超純水（18MΩ，TOC3ppb），牛乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg；ACQUITY UPLC®超高效液相色譜系統(tǒng)，配Acquity TUV檢測器、FILTER MIXER （425μl，P/N 205000403）。
數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
Empower 2 中文版
前處理方法
稱取0.20 g奶粉樣品或2ml液態(tài)奶樣品，添加8mL（對于液態(tài)奶添加6ml）0.3M 的氯化鈉（含0.2%的TritonX-100）溶液溶解，震蕩混勻；然后用0.3%的T FA水溶液調(diào)節(jié)pH至4.4-4.6之間（以沉淀酪蛋白，其等電點為4.6，需要認(rèn)真控制pH，因為乳清蛋白的等電點為4.8），定容至10 mL，均質(zhì)5分鐘，室溫靜置1個小時左后，2500轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液過0.2um濾膜。
結(jié)果與討論
標(biāo)準(zhǔn)配制
三種乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)均用超純水稀釋，配制成不同濃度的標(biāo)樣進行檢測，可得到較好色譜峰形，并且配制簡單。
檢測波長的選擇
應(yīng)用Waters PDA檢測器掃描得到三種乳清蛋白的紫外吸收光譜圖，如圖1至3所示。
乳清蛋白在220nm和280nm下都有紫外吸收，本文選擇兩種波長對三種乳清蛋白（濃度均為5ppm）進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然分析物在220nm下具有最大的紫外吸收，同時在該波長下其也具有較高的基線噪音和干擾，因此本文選擇280nm作為檢測波長，減少流動相中的基線干擾，如圖4所示5ppm的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
流速、流動相優(yōu)化
如圖4三種牛乳清蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖，按照保留時間依次是Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg，對于高分子量的蛋白分析，采用Waters孔徑為300À的ACQUITY UPLCBEH300 C18色譜柱進行分離，此外,考慮到大分子蛋白的傳質(zhì)特性，需要使用較小的流速，方能實現(xiàn)較好的分離。本文試驗了0.1ml/min、0.2ml/min和0.3ml/min三種流速，0.1ml/min死時間達到2.5min，整體出峰時間較晚，峰寬加大，最終綜合峰形、快速和分離度考慮選擇0.2ml/min流速，如圖4所示。
在當(dāng)前的分析條件下Bα-La具有較好的保留，然后改變流動相配比，得到標(biāo)準(zhǔn)品的四種配比色譜圖（如圖5），由圖可以看出，1號色譜峰圖中Bβb-Lg和Bβa-Lg兩種遺傳變異體達到完美的分離（分離度=2.79）；隨著梯度的變化，在保持Bα-La保留時間不變的情況下，逐漸加快Bβb-Lg和Bβa-Lg的出峰時間，兩種化合物的分離度逐漸變化為1.97（4號色譜圖），靈敏度也稍有增加。但是考慮在分析實際樣品時，減少可能存在的雜質(zhì)對分析物的干擾，本文采用1號色譜圖梯度方法進行檢測。
實際樣品檢測發(fā)現(xiàn)，樣品的Bα-La前面有較多的雜質(zhì)峰存在，因此為防止實際樣品中低保留雜質(zhì)對Bα-La的干擾，對圖5的液相方法Bα-La保留時間進行了調(diào)整（如圖4所示），Bβb-Lg和Bβa-Lg仍具有2.22的分離度。
方法的線性相關(guān)性及檢出限
濃度分別為1.000、5.000、50.000、100.000 mg/L的三種乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)依次進樣，進樣量均為10μ L，外標(biāo)法定量。以峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)進行線性回歸，分別得到Bα-La線性方程A=2.34e3×C-2.36e3，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9997；Bβb-Lg線性方程A=1.32e3×C-1 . 3 0 e 3 ， 復(fù)相關(guān)系數(shù)R 2 = 0 . 9 9 9 5 ； B a - L g 線性方程A=1.24e3×C-1.36e3，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9987。三種乳清蛋白在1.000-100.000 mg/L范圍有良好的線性關(guān)系(如圖6-圖8所示）。并且經(jīng)實驗測定，方法檢測限為1.000 mg/kg，圖9為1.000 mg/L三種乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，此濃度下Bα-La、Bβb-Lg、Bβa-Lg信噪比分別達到8、3和3，其中Bα-La可實現(xiàn)定量要求。
前處理方法討論
前處理中有幾個注意點，首先就是使用含0.2% TritonX-100的0.3M NaCl提取液，盡量不要超過3天，因為實驗發(fā)現(xiàn)3天以后該溶液對乳清蛋白的提取和穩(wěn)定效果會下降。其次樣品加入提取液,調(diào)整pH后需要放置50分鐘以上，因為發(fā)現(xiàn)放置和未經(jīng)放置的樣品，在離心后過濾膜時過濾的難易程度有較大差別，未經(jīng)放置的雖較易過濾膜，但乳清蛋白提取率較低。其關(guān)鍵點還在于提取液pH值的掌握，本文對同一奶粉產(chǎn)品在不同pH下的提取情況進行了比較，如下圖所示，pH在4.4-4.6之間沒有太大差別，但是pH達到4.8和5.0時，Bβb-Lg和Bβa-Lg的峰形變差，尤其是Bα-La的的出峰位置完全被雜質(zhì)所淹沒，因此實驗中需要控制pH值不要超過4.6。
實際樣品檢測結(jié)果
圖11-13分別為兩種奶粉和一種液態(tài)奶實際樣品分析色譜圖及結(jié)果。
由圖14，三種乳清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品、實際樣品和樣品提取液的空白溶液的重疊色譜圖，可以看到，在奶粉和牛奶的提取溶劑中，不存在對樣品中乳清蛋白分析物的干擾。另外參見下圖15，是牛奶樣品和牛奶樣品最后添加標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，可以進一步定性牛奶提取樣品中三種乳清蛋白的存在。同時發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用水或樣品提取液（含Triton X-100的NaCl溶液）定容，進樣檢測對三種乳清蛋白的峰面積基本沒有影響，圖16是兩種定溶液標(biāo)準(zhǔn)品的重疊色譜圖。
由圖14，三種乳清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品、實際樣品和樣品提取液的空白溶液的重疊色譜圖，可以看到，在奶粉和牛奶的提取溶劑中，不存在對樣品中乳清蛋白分析物的干擾。另外參見下圖15，是牛奶樣品和牛奶樣品最后添加標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，可以進一步定性牛奶提取樣品中三種乳清蛋白的存在。
同時發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用水或樣品提取液（含Triton X-100的NaCl溶液）定容，進樣檢測對三種乳清蛋白的峰面積基本沒有影響，圖16是兩種定溶液標(biāo)準(zhǔn)品的重疊色譜圖。
重現(xiàn)性
5ppm標(biāo)準(zhǔn)品八次進樣的重疊色譜圖及重現(xiàn)性結(jié)果
如下:
結(jié)論
本文建立了用Waters UPLC-TUV系統(tǒng)檢測奶粉和牛奶實際樣品中Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三種牛乳清蛋白的定量分析方法。方法的檢出限為1μg/g。使用Waters ACQUITY UPLCBEH300 C18色譜柱和三氟乙酸添加劑流動相，使Bβb-Lg和Bβa-Lg兩種遺傳變異體可達到基線分離；采用280nm檢測波長，有效降低了低波長檢測下的流動相干擾，可以用于奶粉和牛奶中三種牛乳清蛋白的含量測定。
參考文獻
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