快速分析嬰幼兒配方奶粉中標準添加的水溶性維生素

Evelyn Goh
Waters Pacific, Singapore

應用優(yōu)勢
此方法可同時分析 12 種水溶性維生素：

• 替代耗時的單一化合物微生物測定法。
• 在復雜基質(zhì)中如嬰幼兒配方奶粉里檢測低濃度目標物 ( 尤其是維生素 B12) 。
• 一次分析便可同時獲得 MRM 和 全掃描數(shù)據(jù)。

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC® 系統(tǒng)
Xevo® TQ MS
MassLynxTM 軟件
TargetLynxTM 應用軟件
IntelliStart™ 技術(shù)
RADAR™

關(guān)鍵詞
水溶性維生素，維生素 C 、 B3 、 B6 、 B12 、 B1 、 B9 、 B2 、 B7

簡介
維生素是一種微量元素，由于人體內(nèi)無法對其進行合成，只能通過食物攝取。嬰幼兒配方奶粉中的維他命元素對嬰幼兒的健康成長尤為重要，尤其對無法進行母乳喂養(yǎng)、將配方奶粉作為主要營養(yǎng)來源的嬰兒而言。官方的水溶性維生素檢測方法以程序化為基礎(chǔ)，主要是微生物鑒定法，此方法已使用了近十年。為達到提取目的，需對每種維生素都進行單獨分析，進而測定其在食物里的總含量。這通常需耗費大量時間。

使用一種檢測方式同時分析添加營養(yǎng)元素的嬰幼兒配方奶粉中的維生素十分困難，原因在于：

• 維生素結(jié)構(gòu)多樣，化學成分復雜
• 維生素含量低
• 基質(zhì)復雜
• 光和熱下不穩(wěn)定
• 溶解性問題
• 配方奶粉中濃度范圍廣

在此應用文獻中，我們將介紹一種只需五分鐘的快速 UPLC®/MS/MS 質(zhì)譜檢測法，利用 ESI 正模式同時檢測嬰幼兒配方奶粉中的 12 種水溶性維生素。

實驗
在樣品準備和分析階段，所有溶劑均儲存在低于 5˚C 的避光處。維生素標準溶液每日制備。

液相條件
LC 系統(tǒng)：           ACQUITY UPLC 系統(tǒng)
色譜柱：            ACQUITY UPLC HSS T3 ，
                        2.1 x 50 mm ， 1.8 μm
色譜柱溫度：     40 °C
樣品溫度：        4 °C
流速：               0.6 mL/min
流動相 A ：        10 mM 甲酸銨 + 0.1%
                        甲酸水溶液
流動相 B ：        10 mM 甲酸銨 + 0.1%
                        甲酸甲醇溶液
梯度：

總運行時間：    5.0 分鐘
注入量：          10 μL ，全充滿定量環(huán)

質(zhì)譜條件
MS 系統(tǒng)：         Xevo TQ MS
離子化：           ESI+
毛細管電壓：  1.0 kV
源溫度：          150 °C
脫溶劑溫度：  600 °C
脫溶劑氣：       1200 L/ hr
采集：              多反應監(jiān)測 (MRM)
                       及 RADAR 全掃描
碰撞氣：          氬氣 3.5 x 10-3 mbar

標準添加法
當無法獲得空白試樣時，嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素的定量分析將通過標準添加法進行， ( 煙酰胺除外 )* 。在試樣中添加已知濃度 ( 標準溶液 ) 的分析溶液，使任何基質(zhì)效應都可在校準時消除。分析員最初并未知道試樣中分析物的含量，但可對加入的標準溶液的含量以及加入標準溶液后儀器響應的變化進行追蹤。因此，通過校準曲線外推法可測定試樣中分析物的濃度。實踐中，標準溶液的添加體積需保持在少量水平，以避免樣品基質(zhì)的稀釋。

* 試樣基質(zhì)使用現(xiàn)有稀釋系數(shù) ( 見實驗步驟 ) ，無標準品添加，儀器對嬰幼兒配方奶粉中煙酰胺 (B3) 的響應接近檢測器飽和值。如果標準添加法用于煙酰胺，將使檢測器達到飽和。

試樣準備、萃取和標準添加
按嬰幼兒配方奶粉包裝說明上的三倍濃度進行制備。

將 10 毫升嬰幼兒配方奶粉溶液放入用箔覆蓋的聚丙烯 (PP) 管中；加入 20 毫升 100% 濃度的乙醇。

搖晃混勻 2 分鐘，以 3500 RPM 的速率離心 15 分鐘。

上清液用 0.45μmPVDF 濾膜過濾。

將 20μL 上清液轉(zhuǎn)移至樣品瓶，加入 10μL 含 11 種分析物的已知標準濃度溶液，樣品瓶加水至 1 毫升 ( 將試樣基體中的分析物稀釋 50 倍；標準溶液中的分析物最終稀釋 100 倍 ) 。

溶液中煙酰胺標準曲線單獨制備。

通過 LC/MS/MS 進行分析。

采集和數(shù)據(jù)處理方法
通過 MassLynx 軟件 v.4.1 版本獲取數(shù)據(jù)，使用 TargetLynx 應用管理軟件進行數(shù)據(jù)處理。
使用 IntelliStart 技術(shù)對 12 種目標維生素進行自動 MRM 采集方法優(yōu)化。 IntelliStart 只需輸入復合物的基本信息，即可自動找到母離子，優(yōu)化錐孔電壓，找到子離子并優(yōu)化碰撞能量。

每種維生素的 2 個 MRM 通道均已得到優(yōu)化；第一個通道為定量離子通道，第二個通道為定性離子通道。通道的駐留時間自動得到優(yōu)化，每個色譜峰最少有 12 點以保證定量重現(xiàn)性。分析物的 MRM 通道、錐孔電壓、碰撞能量、以及保留時間詳見下表 1 。

表 1. 檢測水溶性維生素的 LC/MS/MS 參數(shù)

除 MRM 數(shù)據(jù)外，使用 Xevo TQ MS 的 RADAR 模式可獲得全掃描數(shù)據(jù)。 RADAR 是一種可獲得豐富信息的采集方法，獲取 MRM 數(shù)據(jù)的同時可實時獲取試樣基質(zhì)的背景質(zhì)譜信息。使用 RADAR 不會影響 MRM 數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

結(jié)果與討論
ACQUITY UPLC 系統(tǒng)結(jié)合 Xevo TQ MS 的 ESI 正離子模式成功分析了 12 種水溶性維生素。使用 ACQUITY UPLC 可在 5 分鐘內(nèi)快速分離所有分析物，包括 1 分鐘平衡時間，詳見圖 1 。

在同一分析檢測中，使用 Xevo TQ MS 的 RADAR 模式監(jiān)測嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)中化合物的全掃描質(zhì)譜信息。 RADAR 利用 Xevo TQ MS 的快速采集速率獲取全掃描 MS 數(shù)據(jù)，且同時在 MRM 模式下得到足夠的分析物峰點數(shù)，以準確定量和定性。

通過 RADAR 可觀察試樣基質(zhì)中的雜質(zhì)，并了解可能造成基質(zhì)效應的化合物含量和類別。這對 LC-MS/MS 方法開發(fā)過程中優(yōu)化方法以降低基質(zhì)影響帶來幫助。例如，可通過調(diào)整分離方法使得目標峰與可能引起基質(zhì)影響或離子抑制的區(qū)域分離。圖 1 中插入部分為從嬰幼兒配方奶粉試樣基質(zhì)全掃描數(shù)據(jù)中提取的質(zhì)譜圖。

此方法檢測了兩種不同大眾品牌的嬰幼兒配方奶粉。圖 2 顯示的是從其中一種品牌里提取的水溶性維生素定量離子色譜圖。

回收率與重現(xiàn)性
通過比較提取前加標樣品和提取后加標樣品得到回收率。實驗分兩天檢測兩種不同品牌的嬰幼兒配方奶粉，每日重復進行 6 次。
每種嬰幼兒配方奶粉的大部分化合物都達到了 ≥90% 的提取回收率，吡哆醛、葉酸和核黃素 -5’- 磷酸除外，回收率相對較低的主要原因是上述物質(zhì)的水溶性較差。
盡管嬰幼兒配方奶粉是一種非常復雜的基質(zhì)， 6 個重復樣的相對標準偏差 (RSDs) 仍然都低于 5% 。這顯示了該方法的高重現(xiàn)率以及穩(wěn)定性。

線性和定量
線性動態(tài)范圍、靈敏度和適合性可通過標準添加法進行評測。標準添加法的一大優(yōu)勢是可避免測定基質(zhì)效應，消除離子抑制的影響。
得到相關(guān)系數(shù) ≥0.99 的較好線性關(guān)系，如表 3 所示，所有進行分析的嬰幼兒配方奶粉濃度范圍不同：抗壞血酸（ C ）為 10 - 10000 ng/mL ；氰鈷胺（ B12 ）為 0.1 - 10.0 ng/mL ；其余分析物為 1 到 100 ng/mL 。數(shù)據(jù) 3 顯示的是以標準添加法為基準的一種嬰兒配方奶粉抗壞血酸（ C ）和氰鈷胺（ B12 ）的校正曲線。

圖 3. 使用標準添加法的 A 配方奶粉的抗壞血酸和維生素 B12 校正曲線。

校正曲線為外推法，由于考慮到稀釋因素 (50 x) ， x 軸截距絕對值顯示嬰幼兒配方奶粉中分析物的濃度。 Xevo TQ MS 的靈敏度讓我們可稀釋樣本以降低基質(zhì)效應，同時仍可檢測到目標化合物。

結(jié)論

一個使用 ACQUITY UPLC 與 Xevo TQ MS ESI 正模式 5 分鐘快速測定法，用于同時分析 12 種水溶性復合維生素。此法替代了耗時的維生素單獨分析法。通過將不同維生素分析法融為一體，實驗室可提高試樣分析量、減少容積消耗、降低運作成本。

Xevo TQ MS 的高靈敏度可實現(xiàn)在非常復雜的基質(zhì)中檢測低濃度目標分析物 ( 尤其是氰鈷胺 ) ，如嬰幼兒配方奶粉。 Xevo TQ MS 可達到低定量限，稀釋試樣來降低基質(zhì)效應。

RADAR 技術(shù)可監(jiān)測基質(zhì)干擾，雜質(zhì)和樣品中的降解物，同時準確定量目標分析物。分析員在檢測基質(zhì)效應時便可做出準確決策，并可準確評價基質(zhì)效應是否有存在。

IntelliStart 技術(shù)簡化系統(tǒng)準備和 MRM 方法開發(fā)，確保所有層次的科學家均可快速準確地操作儀器，生成最高質(zhì)量的可重現(xiàn)的 UPLC/MS/MS 數(shù)據(jù)。

參考文獻

1. AOAC Official Method 985.32, Microbiological Method for Analysis of Vitamin B6 (Pyridoxine, Pyridoxal, Pyridoxamine) in Ready-to-feed Milk-based Infant Formula.
2. AOAC Official Method 992.07, Microbiological Turbidimetric Method of Pantothenic Acid in Milk-based Infant Formula.