病毒顆粒的等電位滴定曲線用于指導(dǎo)離子交換層析工藝開發(fā)

病毒顆粒的等電位滴定曲線用于指導(dǎo)離子交換層析工藝開發(fā)

 

S. Herzer¹, P. Beckett ¹ , T. Wegman ², and P. Moore¹

¹Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ, USA; ²Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

 

    使用電泳滴定曲線（ETC）測定病毒顆粒的電荷性質(zhì)，是層析純化法過程中的一個部分。病毒顆粒的CyDye™ 標(biāo)記和使用Typhoon™掃描儀對其在凝膠中的檢測是一種快速且靈敏的工具，可以用于預(yù)測完整病毒在離子交換柱上的層析行為。ETC結(jié)果有助于離子交換介質(zhì)和分離條件的選擇。 本文報告了腺病毒和麻疹病毒的結(jié)果。該方法也適用于腺相關(guān)病毒（AAV）、鼠白血病病毒和細(xì)菌噬菌體如lambda和M13等。

 

    電泳滴定曲線（ETC）是測定預(yù)置的pH范圍內(nèi)生物分子電荷性質(zhì)的強(qiáng)有力的工具。蛋白質(zhì)混合物的ETC有大量的參考文獻(xiàn)^[1-10] ，并且它們常用于離子交換層析法的評估和預(yù)測^{[1, 7]} 。

 

    基因治療和疫苗對大量高純度病毒顆粒的要求，使得層析分離純化倍受關(guān)注^[11-14] 。病毒顆粒的復(fù)雜性和易碎性影響了實驗中對其電荷性質(zhì)的估計。在pH梯度中的瓊脂糖凝膠電泳具有環(huán)境相對溫和的優(yōu)點。我們在此描述了一種快速、可重復(fù)的、敏感的方法，為進(jìn)行完整病毒顆粒的層析分離確定一個有用的工作pH。

 

    除特殊說明外，包括細(xì)菌噬菌體在內(nèi)的全部材料都來自Amersham Biosciences公司。制備緩沖液的一般化學(xué)藥品都來自Sigma, Aldrich。SYPRO™ Ruby來自Molecular Probes。所有其他的病毒都來自ATCC，麻疹病毒除外(由Rochester, MN  梅奧診所的M. Federspiel教授友好捐贈）。

 

方法

    CyDye™熒光標(biāo)記在能保持病毒穩(wěn)定性的弱堿性pH環(huán)境中完成。 為避免過度標(biāo)記和交聯(lián)僅使用單活性基染料。標(biāo)記環(huán)境保持在低的溫度(在冰上）或在短時間內(nèi)進(jìn)行，以確保病毒顆粒的表面電荷性質(zhì)不被過度標(biāo)記所影響。

 

    其他的步驟都按照制造廠家的說明書進(jìn)行，除非另有說明。瓊脂糖ETC凝膠中加入5%甘油以防止發(fā)生凝集，這種凝集在被掃描的凝膠上顯示為大片彌散。

 

    按照如下程序在PhastSystem™快速凝膠電泳儀上運(yùn)行瓊脂糖ETC凝膠：第一步，以2000V,20 mA/gel , 15 , 7 W ℃ 經(jīng)110Vh，以形成pH梯度；在110 Vh時停止電泳，將凝膠旋轉(zhuǎn)90°。在第一步和第二步期間仔細(xì)標(biāo)記陰極的方向。 應(yīng)用只包含完整的除去鹽分的病毒顆�；蚣�(xì)胞溶解產(chǎn)物的樣本，使用跨過凝膠的寬度和pH梯度的滴定曲線點樣器或小的切口加樣。病毒樣本在1000V 20 mA/gel, 15 , 7 W ℃ ，經(jīng)40-60Vh被電荷/pH所分離。經(jīng)適當(dāng)設(shè)置的Typhoon掃描儀間隔掃描分離的過程。

 

    按照制造廠家的說明書控制瓊脂糖ETC凝膠在快速電泳儀上運(yùn)行，并在Typhoon掃描儀上用SYPRO Ruby觀察。

 

    層析法使用HiTrap™ IEX Selection Kit, RESOURCE™ S和  RESOURCE Q柱分離病毒顆粒。選擇根據(jù)ETC確定的pH值用于分離，將除鹽的或稀釋的病毒（在> 5 mS/cm時，適當(dāng)?shù)膒H值) 用平衡好的層析柱分離。一般而言，在低強(qiáng)度緩沖液（緩沖液A，如適當(dāng)pH值的25-50mM Tris)中平衡柱子，用1-3倍柱體積(CV)的病毒上樣。

 

    至少1-2倍CV洗柱，再以10倍CV緩沖液A和梯度到100%緩沖液B洗脫病毒，此處緩沖液B包含適當(dāng)?shù)柠}分以確保病毒穩(wěn)定，例如1M NaCl （需要考慮兼容性）。自始至終按照0.25-0.5CV收集組分。

 

    根據(jù)病毒的傳染性或利用Sepharose™6 Fast Flow(17-0159-01) 的Triccorn 5/10柱或MicroSpin™ S-400 HR Column (27-5140-01)分析收集的組分。用凝膠電泳分析收集的外水體積以確定病毒結(jié)合特性。

 

結(jié)果和討論

    為確保CyDye標(biāo)記不對病毒電荷行為產(chǎn)生較大影響，已檢驗過的兩種病毒載體在未標(biāo)記之前也在瓊脂糖ETC上分離。凝膠被染色^[15]，并且在遷移模式上僅觀察到有輕度的改變（數(shù)據(jù)未列出）。

 

    以Cy™5標(biāo)記的腺病毒(AV)的瓊脂糖凝膠電泳表明，AV在pH值從5至10的范圍內(nèi)整體來說表面帶負(fù)電荷，而在pH低于5時帶正電荷（圖1）。這與組成腺病毒的六聯(lián)體、五聯(lián)體和纖維蛋白的等電點相一致^[16]。為確定有助于純化的pH范圍，也采用電泳法將未標(biāo)記的原材料分離出來，并以SYPRO Ruby染色（數(shù)據(jù)未列出）。

 

    在pH值為8的Q Sepharose XL上能從粗培養(yǎng)液中將病毒分離出來（圖2）。可以使用較低的pH值；然而，結(jié)合能力將受影響。

 

    在pH為8時，緩沖液A中能使用達(dá)300 mM的NaCl，但是這樣與在緩沖液A中無NaCl時進(jìn)行的分離相比，柱子的結(jié)合能力會降低一半（數(shù)據(jù)未列出)。

 

 

圖1、腺病毒標(biāo)記的Cy5在2%瓊脂糖

IEF凝膠、pH梯度為3-10中的瓊脂糖

凝膠電泳圖。陰離子和陽離子交換（分

別為AIX、CIX）的等電位點及可能的

pH范圍如圖所示。

 

 

 

 

 

 

 

檢測波長：  260 和 280 nm

 

 

 

圖2、采用陰離子交換對細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的腺病毒進(jìn)行分離。上樣前采用Benzonase™核酸內(nèi)切酶處理裂解物。箭頭為腺病毒峰。其純度與采用CsCl離心處理的兩次純化相當(dāng)。

 

圖3、紫外線滅活Cy3標(biāo)記麻疹病毒

在2%瓊脂糖凝膠、pH梯度為3-10

中的分離，pI，pH值和上樣槽如圖

所示。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

圖4、采用ETC在pH范圍為3-9的

IEF凝膠中對病毒樣本進(jìn)行的分析。

凝膠采用SYPRO Ruby染色， 采

用Typhoon掃描儀對電泳帶進(jìn)行

檢測。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    使用毛細(xì)管等電聚焦分析5型AV的穩(wěn)定性已被描述^[17] 。然而，這是首次被描述的使用電泳滴定曲線測定完整病毒顆粒的電荷行為。

 

    也采用ETC對經(jīng)320nm紫外線照射15分鐘滅活的麻疹病毒進(jìn)行了分析。瓊脂糖凝膠電泳曲線證實在PH值低于7時病毒帶正電荷，在pH值高于7時帶負(fù)電荷（圖3）。然而，在pH值高于7時，持續(xù)存在嚴(yán)重的聚集問題。根據(jù)在PH值高于7時對未滅活的麻疹病毒進(jìn)行的實驗，聚集問題看似是常見的，并且不是由于紫外線照射處理所致。然而，紫外線交聯(lián)可能增加聚集。

 

    根據(jù)ETC的結(jié)果，選擇陽離子交換法分離麻疹病毒。該方法選擇也通過污染物的電泳分析法證實，電泳分析法證實大量污染物在pH > 5.5時帶負(fù)電荷（圖4）。這有點意外，因為麻疹病毒兩種包膜蛋白的等電點表明該病毒在pH值高于5.5時應(yīng)該是帶負(fù)電荷^[18-20] 。這些觀察結(jié)果表明以經(jīng)驗為主而不是基于蛋白質(zhì)序列或個別蛋白質(zhì)等電點來確定電荷性質(zhì)的有用性。在此基礎(chǔ)上，選用pH值為6.5的條件，SP Sepharose XL成功的純化了麻疹病毒（圖5）。 

 

    離子交換層析也可應(yīng)用于腺相關(guān)病毒(AAV)、鼠白血病病毒和細(xì)菌噬菌體如lambda  和M13的純化（數(shù)據(jù)未列出）。AAV的分析表明：在pH值高于7時，整體凈電荷為負(fù)，并且在低于中性pH時整體凈電荷為正。污染物在pH為5-5.5以上時看似像帶負(fù)電荷。使用SP Sepharose High Performance從細(xì)胞溶解產(chǎn)物中純化AAV，再利用SOURCE™ 30 Q精細(xì)純化純化效果較好[21]。  

 

    莫洛尼小鼠白血病病毒在pH高于6時表現(xiàn)出整體凈負(fù)電荷，在pH低于6時為凈正電荷。這與已描述的表面蛋白的等電點相一致(22–25)。在高于和低于那個pH時，電荷以快速增加的偏移速度急劇轉(zhuǎn)換。污染物看似在pH值為5–5.5以上時也是主要帶負(fù)電荷，然而，在5.5–8的pH值范圍內(nèi)電荷輕度增加。RESOURCE Q上的陰離子交換層析用于分離MLV與它的主要污染物（數(shù)據(jù)未列出）。

 

檢測波長：260 和 280 nm

 

 

 

 

圖5、在pH 6.5下在SP Sepharose XL中對紫外線滅活麻疹病毒所進(jìn)行的分離。 黑線所示為含有病毒的組分（基于凝膠過濾分析數(shù)據(jù)）。 

 

    電泳滴定曲線是一種用于初步篩選病毒顆粒的離子交換層析條件的簡單、快速的方法。此處描述的該方法依靠CyDye標(biāo)記和使用Typhoon掃描儀觀察，用于病毒顆粒的快速和敏感的檢測。 如上所述， ETC被用于確定一個適當(dāng)?shù)膒H范圍以進(jìn)行完整病毒顆粒的離子交換層析。在某些情況下，僅能依靠經(jīng)ETC電泳滴定產(chǎn)生的經(jīng)驗數(shù)據(jù)來確定適當(dāng)?shù)膒H范圍，而已經(jīng)發(fā)表的衣殼蛋白質(zhì)的等電點并不適用于確定病毒純化條件。

 

 

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