WAVETM 生物反應器中的 Cytodex™ 微載體細胞培養(yǎng)工藝

 

    WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)多用于懸浮細胞的培養(yǎng)。然而，用于細胞治療和疫苗生產(chǎn)的多種細胞為貼壁依賴型的，需要一個可貼附的生長表面。在本研究中，Cytodex 微載體被應用在 CellbagTM 生物反應器中以擴增 Madine-Darby Canine Kidney (MDCK)和 Vero細胞。為了優(yōu)化細胞貼附，測試了兩種細胞株的不同搖動混合條件。我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分對細胞貼附有顯著的影響；例如在低血清培養(yǎng)基中的 MDCK 和 Vero細胞，用間歇式和連續(xù)搖動混合都可以使細胞貼附到微載體上。然而，在無血清條件下，Vero細胞在間歇式搖動混合下可以獲得高貼壁率。生長在 WAVE  Bioreactor系統(tǒng)中的MDCK細胞可以被放大到2 L和10 L工作體積。 細胞達到最大密度為3×106細胞/ml。Vero 細胞在 2  L 工作體積下的Cytodex 1和Cytodex 3微載體上培養(yǎng)，無血清條件下達到 1.4×106細胞/ml 最大密度。用轉瓶同樣條件可以獲得相同密度的Vero細胞，WAVE中細胞生長速度更快。

 

    數(shù)據(jù)顯示 WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)是成功用于 MDCK 和 Vero 細胞微載體培養(yǎng)的通用平臺，可以方便的進行規(guī)模放大，是對傳統(tǒng)攪拌罐生物反應器或轉瓶的一種快速和方便的替代系統(tǒng)。

 

    介紹

    與滾瓶  (Roller Bottle)中的細胞培養(yǎng)不同，貼壁細胞在微載體上的培養(yǎng)使它相對容易進行生產(chǎn)工藝的規(guī)模放大。此外，微載體使細胞能夠在生物反應器中擴增，與多個小T型瓶等塑料培養(yǎng)容器相比，生物反應器可以提供更好的工藝參數(shù)自動控制，降低勞動強度的同時減少污染的危險。一次性生物反應器的使用減少了投資成本、提高靈活性（簡化批次間的輪換準備等操作） ，消除了生產(chǎn)容器清洗驗證的需要。

 

    WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)是設計用于人、動物、植物和昆蟲細胞培養(yǎng)的一次性發(fā)酵設備， 并可以用于細菌和真菌的培養(yǎng)。 WAVE Bioreactor系統(tǒng)不需要清洗或滅菌， 這減少了生物制藥生產(chǎn)中工藝驗證的需要。盡管WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)多用于懸浮細胞的培養(yǎng)，本文的研究表明WAVE反應器也適合微載體上貼壁細胞的培養(yǎng)。

 

    本文描述了 MDCK 和 Vero 細胞在 WAVE Bioreactor 系統(tǒng)中 Cytodex 微載體上的培養(yǎng)。我們對微載體培養(yǎng)所必需的參數(shù)如最佳搖動混合條件和工作體積范圍、細胞貼附效率、最大細胞密度以及從 2  L工作體積放大到10 L的可行性進行了深入研究。使用細胞特異性的參數(shù)如貼附、生長速率和最大細胞密度等，對 WAVE  Bioreactor系統(tǒng)和轉瓶培養(yǎng)進行了比較和評價。WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)中貼壁細胞培養(yǎng)的一般操作程序如圖1所示。

 

    細胞株，培養(yǎng)基和儲存液  MDCK細胞來自ECACC (Nr. 84121903)。細胞培養(yǎng)在含有 2%  FBS  (CH30160.03, HyClone)的 UltraMDCK  (12-749Q,  Lonza)培養(yǎng)基中。細胞在T型瓶和細胞工廠中的常規(guī)培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)中的接種過程中，MDCK 細 胞 先 用 PBS-EDTA  (E8008, Sigma  Aldrich)洗滌，然后用 accutase 酶(L11007, PAA Laboratories)進行消化。

 

    Vero細胞來自ATCC (Nr. CCL 81)。使用DMEM/Ham’s 為基礎的無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。使用含0.2% Pluronic F68 (Sigma Aldrich)的培養(yǎng)基在WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)中進行細胞括增。在T型瓶和細胞工廠的常規(guī)培養(yǎng)中使用胰蛋白酶（Gibco BRL）消化細胞。源于大豆(1 mg/ml in PBS)的胰蛋白酶抑制劑STI (Sigma Aldrich)和EDTA用于胰蛋白酶消化的終止。Vero細胞在接種到微載體之前用0.02% EDTA 消化。然后補加培養(yǎng)基。

 

    培養(yǎng)容器  在常規(guī)培養(yǎng)中，MDCK細胞生長在T 型瓶和多層細胞工廠（Corning Life Sciences，Sigma Aldrich）中用于接種準備。

    在常規(guī)培養(yǎng)中Vero 細胞生長在T型瓶和多層細胞工廠中，用于接種準備。在125 ml Techne轉瓶(Spinner Flask,  Bibby-Scientific Ltd)中進行細胞培養(yǎng)，工作體積為60 ml。Spinner Flask轉瓶以50 rpm攪拌混合。

 

    微載體  Cytodex  3微載體被用于MDCK細胞的貼壁培養(yǎng)，Cytodex  1 和 Cytodex  3 被用于Vero細胞的貼壁培養(yǎng)。微載體在硅化國的玻璃容器中進行水化和高壓滅菌。在用不含Ca2+和Mg2+離子的PBS中洗滌3次后，微載體在121℃高壓滅菌15 min，并在 4℃下無菌保存。微載體先用培養(yǎng)基洗滌并在接種前24  h轉移到Cellbag中進行平衡。所使用的Cytodex 1和Cytodex 3 的量為3 g/l。為了防止微載體吸附到玻璃表面，轉移瓶和轉瓶都經(jīng)過 Sigma  Cote  (Sigma Aldrich)硅化處理。

 

    用于MDCK和 Vero細胞的生物反應器  WAVE  Bioreactor 系統(tǒng)由一個帶有一次性塑料細胞培養(yǎng)袋的搖動平臺組成，配備CO₂ 氣體混合器 (CO2MIX20) 或WAVEPOD™控制塔用于控制pH、溫度、氧氣和混合。MDCK細胞在Cellbag-10 L和Cellbag-50  L的WAVE  Bioreactor System 20/50中培養(yǎng)。Vero細胞在Cellbag-2 L和Cellbag-10 L的WAVE Bioreactor  System 20/50中培養(yǎng) 。WAVEPOD 控制塔用于pH、溫度、氧氣和混合等參數(shù)的監(jiān)測和反饋控制。

 

    染色溶液  使用溶解于0.1 M檸檬酸中的0.1%結晶紫細胞裂解緩沖液進行 MDCK和 Vero 細胞的細胞核計數(shù)。臺盼藍（0.1%溶解在PBS中）用于測定細胞活率。 對于Vero細胞， 用于細胞固定和微載體培養(yǎng)物顯微鏡觀察的 Hematoxylin 蘇木紫染料溶液  (Carl Roth GmbH)由 0.9 g蘇木紫、0.18 g NaIO₃、15.45 g Al K(SO4)₂ ×12 H₂0、45 g 水合Chloralhydrate (Carl Roth GmbH) 和1 g  一水檸檬酸溶解于1 L的蒸餾水中配制而成。

 

    細胞培養(yǎng)-MDCK細胞  MDCK細胞按照1:5到1:6每周傳代兩次。對于常規(guī)細胞培養(yǎng)和微載體接種，MDCK細胞先用 PBS-EDTA 洗滌，然后通過與Accutase酶在37℃孵育30 min使細胞從微載體上脫落。我們?nèi)〕鲆徊糠置撀涞腗DCK 細胞樣品并用 CEDEX  (Innovatis)測定細胞活率，此結果被用于計算達到目標接種密度所需的細胞數(shù)量。使用轉移瓶將懸浮細胞加入到Cellbag中。

 

    細胞培養(yǎng)-Vero細胞  Vero 細胞按照 1:3 到 1:4 每周傳代兩次。在這種條件下，經(jīng)過胰蛋白酶消化的微載體接種難度較大，因為胰酶容易削弱細胞貼附從而影響細胞在微載體上的鋪展。因此， 細胞用含有0.02 % EDTA的無Ca ²⁺ 和Mg ²⁺的PBS 從細胞工廠表面消化。10 層細胞工廠用 PBS 洗滌，細胞用100 ml EDTA 溶液消化后在37℃孵育 20 min。孵育后，我們加入500 ml的細胞培養(yǎng)基并合并所有細胞層的接種物。我們抽取一部分細胞樣品用細胞血球計數(shù)器計數(shù)。使用臺盼藍染色（0.1%臺盼藍溶于PBS）測定細胞活率。下一步，我們測定達到特定接種密度所需要的懸浮細胞量，然后轉移瓶中的細胞通過無菌焊接加入到Cellbag中。

 

    取樣  每天對細胞取樣以確定密度和形態(tài)。在取樣前，適當提高反應器的攪拌速率以保證微載體均勻懸浮 （對Cellbag-2 L為16 rpm和12^°，對Cellbag-10 L為18 rpm和5°）。在提高攪拌速率2 min后，從取樣口取出4 ml載體懸液，同時反應器保持連續(xù)搖動。然后反應器的攪拌參數(shù)被恢復到細胞培養(yǎng)時的工作參數(shù)，將樣品轉移到離心管中。先沉降微載體，丟棄上清，將含有 Vero細胞的微載體重懸在1 ml 含有0.1%結晶紫的0.1 M檸檬酸溶液中，然后孵育1.5 h。釋放出的細胞核用血球計數(shù)器計數(shù)。對于MDCK 細胞，載體重懸在含有0.1%結晶紫的檸檬酸和Triton  X-100溶液中。然后載體懸液被漩渦振蕩30 s，使用 Bürker chamber計數(shù)細胞核。

 

    0.5 ml Vero細胞微載體懸液被轉移到小離心管中。在微載體沉降后，丟棄上清，貼在微載體上的Vero細胞使用0.3 ml蘇木紫溶液固定并染色。微載體在顯微鏡下放大100倍進行觀察，用于顯微拍照。

 

    微載體培養(yǎng)的最佳工作體積  確定Cellbag-10 L和 Cellbag-50 L的最佳工作體積。培養(yǎng)袋中的推薦工作培養(yǎng)體積為最大推薦體積的40 %（即Cellbag-10 L為2 L，Cellbag-50 L為10 L）。微載體密度為3 g/l Cytodex 3，接種密度為0.3×10⁶細胞/ml。對每種Cellbag和培養(yǎng)體積，分別測試以下?lián)u動條件：10 rpm和5^º、12 rpm和5º、14 rpm和5º和12 rpm and 6^º。 

 

    微載體培養(yǎng)的最佳混合條件  對于工作體積為2 L的 Cellbag-10 L進行最佳混合的研究。在Cellbag-10  L中培養(yǎng)基和微載體在 37℃和 5%二氧化碳通氣下平衡 2  h。按照 0.3×106細胞/ml 的初始密度接種， 并在細胞-微載體貼附階段使用連續(xù)的搖動方式。細胞生長 18  h 達到大約0.6×106細胞/ml 的細胞密度后，以階梯方式逐漸提高搖動速度。在 5º、6º 和7º 下分別對初始搖速12 rpm進行測試。 搖速按照階梯方式每小時逐漸提高，直到細胞開始從微載體上脫落。

 

    微載體培養(yǎng)的最佳工作體積和混合速度的確定當我們使用 20%到 80%的Cellbag最大工作體積時，微載體培養(yǎng)可以產(chǎn)生均勻的微載體混合分布（圖 2）。

 

    在工作體積小于 20%的 Cellbag 最大工作體積時，部分微載體有可能粘在 Cellbag上，而超過80%工作體積可能會產(chǎn)生不均勻的微載體混合。

 

圖 3顯示搖動角度為5º、6º和7º時所獲得的微載體均勻混合。超過8 rpm的搖動速度產(chǎn)生均勻的微載體混合效果。在搖動速度為16 到 20  rpm時MDCK細胞從微載體上脫落。

 

 

    研究的目的是為了找到在WAVE Bioreactor System 20/50（細胞培養(yǎng)體積達到 25L）中MDCK細胞貼附到Cytodex  3微載體的最佳條件，在培養(yǎng)前4  h 的貼壁階段，我們比較了3種不同的混合方式：

 

1） 間歇混合：每 30 min 以 12 rpm 和 6º間歇混合2 min（圖4），其他時間停止搖動；4 h 后采用連續(xù)搖動(10 rpm和 5º)

 

2） 半間歇混合：每30分鐘以12 rpm 和6º加速混合2 min，其他時間保持6 rpm 和3.3º的低速連續(xù)搖動。4 h后采用連續(xù)搖動(10 rpm和5º)

 

3） 連續(xù)搖動混合：搖動速度8 rpm和5º。4 h后采用連續(xù)搖動(10 rpm和5º)

 

    微載體用量為3 g/l的 Cytodex3，接種細胞密度為0.3×106細胞/ml。培養(yǎng)條件為37℃，pH 7.3，5% CO2，采用光纖溶氧電極監(jiān)測溶氧水平。培養(yǎng)基含有 2%  FBS。每小時取樣并用結晶紫染色測定總細胞密度，上清中的懸浮細胞和死細胞用臺盼藍染色。MDCK細胞在接種后1 h開始貼附到微載體表面（圖 7A）。培養(yǎng)3 h后，85%的接種細胞貼附（圖7B）。18 h后，細胞在微載體表面鋪展并開始生長（圖7C）。

 

    盡管連續(xù)混合能夠使細胞在微載體上產(chǎn)生更均一的分布，但間歇式、半間歇和連續(xù)搖動混合步驟之間沒有觀察到細胞貼壁和生長的任何顯著性差別（圖8、9 和10）。在 2% FBS的低血清條件下，不同的混合步驟表現(xiàn)出類似的結果， 且MDCK細胞的貼壁條件具有很好的耐用性。

 

    Vero細胞貼附微載體

 

    我們使用不同的搖動方案和培養(yǎng)基組成研究Vero細胞對Cytodex 3 微載體的貼附。在Cellbag-2L中以600 ml的工作體積進行細胞培養(yǎng)。連續(xù)搖動參數(shù)被設置為12 rpm和5.5º；以16 rpm和5º間歇搖動2 min；然后設置為0 rpm和0º停止搖動18 min。在6 h 后，上述所有的搖動方式都轉為12 rpm和18º的連續(xù)搖動模式。圖11顯示在含血清條件下，連續(xù)或間歇搖動混合期間可獲得大約90%的細胞貼附。在無血清條件下，間歇式混合方式獲得80%貼附，而連續(xù)混合獲得30%貼附。

 

    MDCK細胞的生長和放大（2% FBS）

 

    為了研究在 Cellbag 生物反應器中 MDCK細胞擴增的可放大性，在兩種不同大小的袋子之間比較最大細胞密度和細胞生長速率 Cellbag-10 L和 Cellbag-50 L。 袋子的工作培養(yǎng)體積采用最大工作體積的40%（即Cellbag-10 L中為2 L，  Cellbag-50 L中為10 L）。

 

    微載體用量為3 g/l的 Cytodex3， 接種細胞密度為0.3×106細胞/ml。MDCK細胞采用搖動速度8 rpm和 5º角度混合。細胞培養(yǎng)期間，在保持角度不變的條件下將搖動速度以階梯方式逐漸從 8  rpm 提高到 14 rpm。培養(yǎng)溫度 37℃，pH  7.4，并監(jiān)測溶氧水平，細胞培養(yǎng)基中含有2% FBS。

 

    經(jīng)過最初的延滯期后，細胞終密度達到3×106細胞/ml，和在轉瓶(Spinner Flask)中所獲得的最大細胞密度類似。 2L和 10L培養(yǎng)體積的細胞生長狀況類似，因此顯示出良好的可放大性（圖12）。

 

    Vero細胞在Cytodex 1和Cytodex 3微載體上無血清培養(yǎng)條件下的生長

 

    接種量為4×105細胞/ml 的Vero細胞在含有2 L無血清培養(yǎng)基的Cellbag-10 L中的分別進行Cytodex 1和 Cytodex 3培養(yǎng)。細胞經(jīng)過間歇搖動混合6 h (16 rpm和4.5º下2 min, 然后0 rpm和 0º 停止搖動18 min)。圖13A顯示Vero細胞在Cytodex 3上培養(yǎng)6 h 后完全鋪展，但是在Cytodex 1上細胞沒有鋪展開來（圖 13 B）。為了提高Vero細胞在 Cytodex 1上的鋪展，培養(yǎng)物停止搖動2 h，改進了細胞在Cytodex 1上鋪展狀況（圖13 C）。之后，在 37℃下兩種培養(yǎng)物都采用連續(xù)搖動的方式繼續(xù)培養(yǎng)（11 rpm和4.5º）。

 

 

    Vero細胞也可以在轉瓶中進行微載體培養(yǎng)。如圖 14 所示，在無血清條件下，WAVE 和轉瓶這兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中可以獲得基本相同的最大細胞密度。相比 Cytodex3，Cytodex  1 具有更大的表面積，因而得到更高的細胞密度。Vero細胞在WAVE  Bioreactor系統(tǒng)中培養(yǎng)過程中，接種 4天后細胞達到匯合。我們觀察到細胞在這兩種微載體上生長迅速，無延滯期（圖14）；相比轉瓶而言，WAVE 反應器中細胞生長速度更快。

 

    透明的 Cytodex 微載體可以不經(jīng)染色直接鏡檢，使用臺盼藍染色可以快速觀察細胞是否達到交匯（圖 16）。活細胞完整的細胞膜將會阻斷臺盼藍染料，并阻止微載體被染色。無細胞覆蓋的微載體很容易被染色，因此可以方便的看到細胞層中的缺陷或空洞。

 

 

    本研究發(fā)現(xiàn)WAVE  Bioreactor系統(tǒng)是一種可以成功用于 Cytodex 微載體培養(yǎng) MDCK 和 Vero細胞的通用生物反應器。MDCK 和 Vero 細胞具有高的微載體貼壁率。我們發(fā)現(xiàn) WAVE Bioreactor系統(tǒng)和轉瓶對于MDCK和Vero細胞的最大細胞密度是相似的， 但WAVE中具有更快的生長速度。對于微載體培養(yǎng)，建議最佳工作體積為最大Cellbag工作體積的20%到80%。 

    MDCK細胞

· 本研究獲得最大細胞密度為3×106細胞/ml，這與使用轉瓶在類似的生長條件下所獲得

的細胞密度相似。

· 我們使用類似的搖動混合條件，成功的將微載體培養(yǎng)從2 L放大到 10 L培養(yǎng)袋。

· 我們優(yōu)化了對 Vero 細胞的接種貼壁操作程序，成功的在無血清條件下獲得 80%以上

的細胞貼壁率。

· Vero 細胞在無血清培養(yǎng)基中成功的在Cytodex 1 和 3上進行培養(yǎng)，可以獲得均勻的細胞分布，最終細胞在微載體上達到交匯。

· 在無血清條件下，Vero 細胞生長達到最大密度，約為1.4×106細胞/ml，細胞密度與在轉瓶中生長的 Vero 細胞相似，WAVE 具有更快的生長速度。