內源性FSTL1 通過激活鈉-鉀泵引起的膜超極化調節(jié)痛覺信息傳遞

 

    突觸是神經細胞間信息傳遞的關鍵部位，信號從一個神經元傳遞到另一個神經元需要通過突觸這一“關卡”。神經元的膜電位和興奮性對于調節(jié)其功能起十分重要的作用。神經元消耗能量，通過鈉‐鉀泵（Na+, K+‐ATPase，NKA）在細胞漿中濃集鉀離子并排出細胞內的鈉離子，從而維持細胞膜內外的鈉、鉀離子濃度梯度，調控神經元的膜電位和興奮性。既往研究證實 ATP、鈉和鉀離子可以調節(jié)鈉‐鉀泵的功能以及一些神經遞質、激素通過它們的受體間接地調節(jié)鈉‐鉀泵活性，還發(fā)現哇巴因（ouabain）以及地高辛可以直接抑制鈉‐鉀泵活性；然而，人體內是否存在鈉‐鉀泵的內源性的激動劑還不清楚。

 

    近日，中科院上海生科院神經所張旭實驗室通過對背根神經節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）的研究，發(fā)現在 DRG 中有一種選擇性高表達的蛋白——濾泡素抑制素樣蛋白1（Follistatin‐like 1，FSTL1）能通過清亮小泡運輸至脊髓內的傳入神經末端釋放，并直接與傳入神經末端突觸前膜上的鈉‐鉀泵 α1 亞基相結合，增強鈉‐鉀泵活性，使細胞膜超極化，從而對傳入神經末端的興奮性突觸傳遞起抑制作用。這一研究發(fā)現了FSTL1 作為第一個被人們認識到的內源性鈉‐鉀泵激動劑在調控突觸傳遞方面的重要作用。

 

FSTL1‐鈉鉀泵系統(tǒng)調節(jié)突觸傳遞的模式圖：膜去極化導致突觸囊泡和FSTL1 囊泡釋放，釋放的FSTL1 激活傳入神經末端突觸前膜上的鈉鉀泵的1亞基，使細胞膜超極化，從而對傳入神經末端的興奮性突觸傳遞起抑制性作用。

    該研究 DNA 微陣列實驗由生物芯片上海國家工程研究中心合作完成。

 

    研究者以背根神經節(jié)（DRG）為研究對象。為了尋找在DRG中發(fā)揮特異功能的分子，研究者利用兩大數據庫（Mouse GeneAtlas database和NCBI）找到了71個可能在DRG中高表達但是在其他組織中低表達的基因。與生物芯片上海國家工程研究中心合作自制點樣芯片，檢測這71種基因在不同組織中的表達豐度。芯片結果顯示FSTL1是DRG表達豐度最高的分子之一。隨后，研究者用Northern blottingh和Western blotting的方法分別檢測FSTL1的mRNA和蛋白表達水平，結果與芯片結果一致。FSTL1 在DRG表達量較高，但在別的組織表達量較低。 對脊髓背角進行蔗糖密度梯度離心實驗，取相同體積的不同比重組份做Western blotting，結果顯示FSTL1 主要存在于清亮小泡中。體外培養(yǎng)大鼠 DRG 神經元檢測培養(yǎng)基中FSTL1的含量，結果顯示在沒有刺激的情況下，FSTL1 能緩慢自發(fā)釋放，而K+離子誘導的去極化也能導致 FSTL1 的釋放。而“whole-cell recording”實驗，純化的FSTL1重組蛋白作用于脊髓背角，會導致興奮性突觸傳導功能的降低。 

芯片結果顯示FSTL1是DRG 表達豐度最高的分子之一。

 

綜上所述，研究者發(fā)現 FSTL1 是一種在 DRG 高表達，但是在別的組織低表達的蛋白；主要存在于清亮小泡，并且通過清亮小泡傳輸；能自發(fā)釋放或者通過刺激依賴的方式釋放；釋放后能抑制興奮性突觸傳導。 

 

隨后研究者開始尋找 FSTL1 發(fā)揮作用的機制， 用帶有 Myc 標簽的重組 FSTL1蛋白孵育培養(yǎng)的大鼠DRG 神經元，BS3交聯與細胞膜上受體結合的 FSTL1，裂解細胞。細胞裂解物做Western blotting，用抗Myc 的抗體進行免疫共沉淀（IP），在 140 kD 處發(fā)現陽性條帶。由于FSTL1 約 40  kD，因此推斷 FSTL1 結合了約100  kD的蛋白。相同的方法富集交聯復合物，用質譜分析發(fā)現結合蛋白可能為 NKA 的 α1 亞基。放免實驗和 co-IP 實驗證明了與 FSTL1 結合的蛋白正是 NKA的 α1 亞基。

 

由于 FSTL1 能通過清亮小泡分泌到胞外，NKA是一種跨膜蛋白。因此推斷，FSTL1 可能是與 NKA的胞外部分結合。研究者合成了 NKA α1 亞基在胞外的肽段， 用 BIAcore 分析這些肽段與 FSTL1 的結合能力，發(fā)現 M3M4 和M7M8 肽段與 FSTL1 的結合能力較強。進一步的細胞實驗發(fā)現 M3M4 和M7M8部位有突變的α1亞基與FSTL1結合能力較弱，從另一個側面證明了以下結論：FSTL1 正是通過與 M3M4和 M7M8 胞外肽段與 NKA α1 亞基結合。 

 

而在培養(yǎng)的 DRG 神經元中加入 FSTL1 重組蛋白能觀察到 NKA 活性的增加，說明 FSTL1 的分泌能激活 NKA。NKA活性的增加會導致傳入神經末端的超極化，從而抑制傳入神經末端的興奮性突觸傳遞。

課題組與南京大學模式動物研究所合作，還從動物水平上對上述現象進行驗證。制備了當時國內第一例條件式敲除小鼠，在DRG中特異性敲除了FSTL1 的基因。研究發(fā)現 FSTL1 條件式敲除小鼠興奮性突觸傳遞增強，痛覺敏感性增加。因此，FSTL1 作為第一個被發(fā)現的內源性鈉‐鉀泵激動劑， 對于保持正常的軀體感覺是必需的， FSTL1 減少則會導致痛覺感受異常。該發(fā)現表明內源性鈉‐鉀泵激動劑可以通過影響突觸傳遞，從而對神經系統(tǒng)功能有重要的調控作用。 

 

原文出處：