開發(fā)用于腦脊液中多種β淀粉樣肽的SPE/LC/MS/MS定量測定方法

Erin Chambers¹、Mary E. Lame²、Diane M. Diehl²、Sarah Grimwood²和Yanhua Zhang³

¹沃特世公司，美國馬薩諸塞州米爾福德，01757；²輝瑞制藥公司神經(jīng)科學(xué)研究部，美國康涅狄格州格羅頓，06340；³輝瑞制藥公司PDM部，美國康涅狄格州格羅頓，06340

β淀粉樣肽（Aβ）的不溶性聚集物在腦中沉積／形成被看作為早老性癡呆�。ˋD）的一個(gè)關(guān)鍵事件。治療策略集中于用以減少β淀粉樣肽生成或提高其清除水平的小分子抑制劑或免疫療法。因此，找到能對腦脊液中的淀粉樣肽進(jìn)行高靈敏且穩(wěn)定可靠的定量分析方法以確定其與AD關(guān)系對很多研究者來說至關(guān)重要。然而，對這些Aβ肽的分析極具挑戰(zhàn)性，這不僅因?yàn)槠湓谏�物液體內(nèi)的豐度相對偏低，而且也因?yàn)樗鼈兛赡鼙黄渌�蛋白質(zhì)結(jié)合并具有形成低聚體的趨勢。

 

這些肽的測定常規(guī)采用免疫測定法（因其選擇性和靈敏度）或者通過冗長的免疫沉淀之后再進(jìn)行SPE。免疫測定所需的方法開發(fā)時(shí)間比LC/MS/MS方法開發(fā)時(shí)間長；它們需要對多種Aβ肽進(jìn)行多次測定，并且與LC/MS/MS相比其線性動(dòng)態(tài)范圍有限。免疫測定存在交叉反應(yīng)性和非特異性結(jié)合，需要使用價(jià)格昂貴的抗體，并且樣品／標(biāo)本的富集依賴于抗體的選擇性。免疫測定的勞動(dòng)強(qiáng)度大，并且測定不準(zhǔn)確和基質(zhì)干擾也是常見的問題。因此，需要開發(fā)一種基于LC/MS/MS的高通量、選擇性好的生物分析方法，使樣品制備能夠?qū)崿F(xiàn)在存在高濃度干擾蛋白和肽的情況下回收得到pg/mL水平的淀粉樣肽。

 

雖然開發(fā)免疫測定方法所需的時(shí)間在后期藥物發(fā)展過程中是可接受的，但在較早的階段中則幾乎不切實(shí)際；這時(shí)，如能有一種可定量多種肽的高通量且可靠的方法則是眾望所歸。

 

本研究工作集中于開發(fā)用于淀粉樣前體蛋白（APP）的1-38、1-40和1-42片段的LC、MS和選擇性SPE樣品制備方法，以支持臨床前研究。使用單一、高通量方法用于多種Aβ肽的分析測定而無需耗時(shí)的免疫沉淀步驟，被成功開發(fā)并經(jīng)過驗(yàn)證。特別是，Aβ類肽存在很多獨(dú)特的分析挑戰(zhàn)，其中包括非特異性結(jié)合、溶解性差、聚集和質(zhì)譜靈敏度偏低。在方法開發(fā)各階段所進(jìn)行的步驟盡可能減小或消除了這些問題所帶來的影響。

 

隨著AD病情緩解策略的出現(xiàn)，對除了Aβ 38、40和42之外的多種可能與AD病征相關(guān)的Aβ進(jìn)行定量分析可有助于提供關(guān)于此病及其發(fā)展過程的更多認(rèn)識。本文所述的方法也有可能進(jìn)行相應(yīng)的修改，以使其適用于那些肽的定量分析。

 

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圖1：β淀粉樣肽1-38、1-40和1-42的氨基酸序列和pI數(shù)據(jù)

色譜柱：   ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈，300Å，2.1×150nm，1.7µm

流動(dòng)相：   A：0.3% NH₄OH（按體積計(jì)算）的水溶液

                   B：90%乙腈，10%流動(dòng)相A

梯度：       90% A保持1分鐘，5.5分鐘內(nèi)降低至55% A并保持0.2分鐘，然后返回至初始水平

流速：       0.2 mL／分鐘

進(jìn)樣量：   10µL

溫度：       50℃

 

系統(tǒng)：沃特世Xevo^TM TQ三重四極桿質(zhì)譜儀，在ESI+MRM模式下運(yùn)行

去溶劑化氣體流速：800L／小時(shí)

源溫度：120℃

去溶劑化溫度：450℃

碰撞室壓力：2.6×10^(-3)毫巴

MRM躍遷態(tài)和條件：見表1

 

用5M鹽酸胍以1:1的比例稀釋200µL腦脊液（人腦脊液、猴腦脊液或加標(biāo)人工腦脊液+5%大鼠血漿），并在室溫下振搖45分鐘。然后，用200µL 的4%H₃PO₄水溶液進(jìn)一步稀釋樣品。

 

注意：對于加標(biāo)樣品而言，在加標(biāo)后、用鹽酸胍稀釋前，可在室溫下讓樣品平衡30分鐘。

 

基于µElution 96孔型的Oasis^® MCX     

預(yù)處理：200µL甲醇

平衡：200µL 4% H₃PO₄水溶液

上樣：600µL預(yù)處理后的樣品

清洗1：200µL 4% H₃PO₄水溶液

清洗2：10% ACN水溶液

洗脫：2×25µL 75:15:10 ACN:水:NH₄OH濃溶液

稀釋：25µL水

進(jìn)樣量：20µL

 

 

圖2：β淀粉樣1-42肽的典型ESI+MS/MS光譜

 

開發(fā)這些方法所遇到的最大挑戰(zhàn)就是克服溶解性、吸附性和聚集性問題并獲得能滿足該應(yīng)用要求的足夠選擇性和靈敏度。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相和進(jìn)樣溶劑構(gòu)成以及明智選擇SPE洗脫溶劑僅僅是應(yīng)對這些問題的幾個(gè)關(guān)鍵因素。

 

質(zhì)譜分析在正離子模式下進(jìn)行，因?yàn)?+前體的CID產(chǎn)生了幾種與固有的特異性b序列離子相對應(yīng)的不同產(chǎn)物離子（典型光譜如圖2所示）。負(fù)離子模式下的MS/MS出現(xiàn)了明顯的水分流失。圖3給出了關(guān)于兩種方法特異性區(qū)別的一個(gè)示例。雖然對于溶劑標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)使用負(fù)離子模式的總體靈敏度較高，但在基質(zhì)存在時(shí)負(fù)離子模式的靈敏度優(yōu)勢減弱，而正離子模式下的特異度和信噪比的提高對于腦脊液樣品中的準(zhǔn)確定量具有決定性作用。

 

圖4顯示了對這三種β淀粉樣肽的分離情況。雖然流動(dòng)相中NH₄OH的精確百分比對負(fù)離子靈敏度具有關(guān)鍵作用，但ESI+模式下的信號經(jīng)證實(shí)對流動(dòng)相構(gòu)成的細(xì)微變化更具穩(wěn)健性，可使液相色譜／自動(dòng)取樣器至少在24小時(shí)以上的時(shí)間段中保持穩(wěn)定。與此相反，50%或以上的ESI-信號在10-12小時(shí)后因流動(dòng)相中NH₄OH濃度的自然變化（揮發(fā)）而損失。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了ESI+MS方法的穩(wěn)健性。

 

SPE使用Oasis^® MCX（一種混合模式的吸附劑）進(jìn)行，以加強(qiáng)萃取過程的選擇性。該吸附劑同時(shí)依賴于反相和離子交換保留機(jī)制，以從復(fù)雜腦脊液樣品中的其它高豐度多肽中選擇性分離β淀粉樣肽組分。使用特定的96孔Oasis^® µElution提供了明顯的濃縮效果，無需溶劑揮干和復(fù)溶，從而盡可能減少了肽損失。此外，通過離子交換進(jìn)行肽結(jié)合為整個(gè)方法提供了正交性。

 

在最初的方法開發(fā)過程中，萃取人工腦脊液時(shí)觀察到了大量非特異性結(jié)合（NSB）。我們添加了5%大鼠血漿（有一個(gè)不同的β淀粉樣肽序列），以消除NSB。

 

SPE是整個(gè)方法中較為重要的環(huán)節(jié)之一。對淀粉樣組分選擇性極高的分離再加上標(biāo)準(zhǔn)流速下UPLC的分辨率實(shí)現(xiàn)了對臨床前研究樣品的超快分析。

 

對每種肽均使用了N15標(biāo)記型內(nèi)標(biāo)。對于0.1-10ng/mL人工腦脊液+5%大鼠血漿的等分樣本，三種β淀粉樣肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈線性。β淀粉樣1-38肽的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。淀粉樣肽的基線水平根據(jù)同時(shí)使用過量加標(biāo)的人腦脊液和“人工腦脊液+5%大鼠血漿”而得到的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，基線水平的計(jì)算值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。選擇人工腦脊液是因?yàn)樗�的價(jià)格不貴，而且是一種比較易得的基質(zhì)。從3種人腦脊液和1種猴腦脊液萃取得到的β淀粉樣1-42肽的基線水平如圖6所示。所有3種β淀粉樣肽的基線水平測定值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

 

用3種人腦脊液混合樣品和1種猴腦脊液混合樣品配制了0.2、0.8、2和6ng/mL的過量加標(biāo)的質(zhì)控樣品。準(zhǔn)確度和精確度數(shù)值符合LC/MS/MS測定的控制標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控樣品分析的典型結(jié)果如表3所示。

 

圖4：UPLC/MS/MS分析萃取自人工腦脊液+5%大鼠血漿的β淀粉樣1-38、1-40和1-42肽

 

化合物名稱：1-38

相關(guān)系數(shù)r=0.996956，r²=0.993921

校準(zhǔn)曲線：0.333755*X+-0.0119724

響應(yīng)類型：內(nèi)標(biāo)（參考品2）面積*（內(nèi)標(biāo)濃度／內(nèi)標(biāo)面積）

曲線類型：線性；來源：單一；加權(quán)：1/x；橫軸：無

 

圖5：萃取自人工腦脊液+5%大鼠血漿中的β淀粉樣1-38肽的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6：顯示3種人腦脊液和1種猴腦脊液中β淀粉樣1-42肽基線水平的典型色譜圖

β淀粉樣1-38肽

β淀粉樣1-40肽

β淀粉樣1-42肽

表3：對用3種人源混合腦脊液制備出的質(zhì)控樣品所進(jìn)行分析的典型結(jié)果

 

1. 我們開發(fā)了一種用于同步定量分析人和猴腦脊液中多種β淀粉樣肽的SPE-LC/MS/MS生物分析方法并對其進(jìn)行了驗(yàn)證。

2. 將基于µElution型混合模式SPE的高選擇性萃取方法與UPLC色譜分析的分辨率相結(jié)合是實(shí)現(xiàn)對人和猴腦脊液中3種主要β淀粉樣肽進(jìn)行準(zhǔn)確、精確而可靠的定量分析的關(guān)鍵。

3. 正離子MS/MS和b離子序列碎片的使用提供了本應(yīng)用所需的質(zhì)譜特異度。

4. 用不到30分鐘的時(shí)間即可完成對96份樣品的萃取并作好進(jìn)樣準(zhǔn)備，從而滿足了臨床前研究所需的樣品制備處理通量要求。

5. 本文所述的方法避免了在臨床前研究工作中進(jìn)行耗時(shí)的免疫測定或免疫沉淀步驟。

6. Xevo TQ質(zhì)譜的質(zhì)量范圍和靈敏度允許選擇高m/z前體進(jìn)行破碎并能選擇特異度高的b離子碎片，從而增加了此項(xiàng)測定的信噪比并總體提高了其特異度。

7. 此類方法也可允許選擇性的、特異性的、并按高通量方式同時(shí)測定一份樣品中的幾種不同β淀粉樣肽，而同時(shí)仍能達(dá)到低濃度內(nèi)源性β淀粉樣肽分析所需的高靈敏度。這是一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)镋LISA測定需要使用多種抗體進(jìn)行多次測定。

 

1. T.A. Lanz、J.B. Schachter．神經(jīng)科學(xué)方法雜志，169 (2008) 16-22.

2. T. Oe等．質(zhì)譜分析中的快速通訊，20 (2006) 3723-3735.

3. JR Slemmon等．色譜分析雜志：生物分析，846 (2007) 24-31.

4. NT Ditto等．神經(jīng)科學(xué)方法雜志，182 (2009) 260-265.

5. T.A. Lanz、J.B. Schachter．神經(jīng)科學(xué)方法雜志，157 (2006) 71-81.

6. MJ Ford等．神經(jīng)科學(xué)方法雜志，168 (2008) 465-474.

7. E. Portelius等．蛋白質(zhì)組學(xué)研究雜志，6 (2007) 4433-4439.

 

本文作者希望向Wenlin Li（輝瑞公司PDM部）表達(dá)謝意，感謝她在使用免疫親和LC/MS/MS分析β淀粉樣肽所作的前期工作。

 

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