場景恐懼實驗方法

 

   暗示與關(guān)聯(lián)條件恐懼（cued and contextual fear conditioning）也加場景恐懼實驗，是基于巴普洛夫條件反射而建立的。它測定動物學(xué)習(xí)、記憶不悅經(jīng)歷（aversive experience）和環(huán)境暗示之間關(guān)聯(lián)的能力。常用聲音或光暗示作為條件刺激（conditioning stimulus，CS），以厭惡性刺激（如足電擊）作為非條件刺激（unconditioned stimulus，US），二者配對出現(xiàn)。經(jīng)過這種CS-US訓(xùn)練，動物不僅學(xué)會聲音和電擊之間存在聯(lián)系，而且知道電擊和周圍環(huán)境之間也存在某種聯(lián)系（context）。前者為聽覺暗示條件恐懼（auditory cue fear conditioning）或暗示條件恐懼（cued fear conditioning），后者為關(guān)聯(lián)條件恐懼（contextual fear conditioning）�？謶质欠庆`長類動物少有的幾種情感反應(yīng)之一。動物經(jīng)歷條件恐懼后，當(dāng)再次接觸條件刺激時，會產(chǎn)生一系列的生理反應(yīng)，包括自主神經(jīng)緊張、應(yīng)激激素分泌增加以及防御行為增多，等等。凝滯（freezing）即是動物防御行為的一種，是指動物除呼吸之外沒有任何其他活動，猶如在黑夜處于迎面而來的汽車強燈照射之下的驚鹿，一動不動。它被認為是評價嚙齒類動物恐懼的可靠指標。

 

   參與條件關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)過程的腦部結(jié)構(gòu)主要為杏仁核和海馬。前者調(diào)節(jié)恐懼，后者調(diào)節(jié)與恐懼性事物相關(guān)聯(lián)的學(xué)習(xí)認知。所以，這一模型主要用于杏仁核和海馬依賴的記憶。動物不需要禁水或禁食，且實驗設(shè)備較為簡單，訓(xùn)練時間相對較短。因此，該模型廣泛用于轉(zhuǎn)基因小鼠敲除小鼠的行為表型研究。

 一、實驗設(shè)備

 

包括條件恐懼箱、隔音箱和關(guān)聯(lián)條件箱，由上海欣軟信息科技有限公司研 發(fā)。條件恐懼箱包括與箱底格柵地板相聯(lián)的電擊發(fā)生器（可產(chǎn)生0.1~1.0mA的各種強度的電擊）、聲音發(fā)生器（可產(chǎn)生寬頻的卡嗒聲或低頻音），并與計算機相聯(lián)。隔音箱裝有一燈、一小風(fēng)扇（用于通風(fēng)和產(chǎn)生背景音）以及一個與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴音器。隔音箱門上有一貓眼，用于觀察操作箱內(nèi)的動物。一個隔音箱內(nèi)可放置兩個操作箱，這樣可同時觀測兩只動物，但兩動物彼此不能互相看見。關(guān)聯(lián)箱由透明有機玻璃制成，有可移動的格柵式地板和紗窗式頂部。為防止動物滑至格柵下面，格柵條之間距離應(yīng)足夠短。對小鼠和年幼大鼠，關(guān)聯(lián)條件箱通常為26cm_*21cm_*10cm；格柵地板由不銹鋼條（直徑1.5mm，中央間距小鼠為0.5cm、年幼大鼠為1.2cm）組成。對成年大鼠，關(guān)聯(lián)箱通常為29cm_*23.5cm_*19.5cm，格柵地板包括16根不銹鋼條（直徑2.5cm、中央間距為1.25cm）。此外，還有電壓計和聲強計，用來檢測刺激強度。

 

一、實驗方法

分為訓(xùn)練和測試兩階段

（一）訓(xùn)練階段（第一天）

1．調(diào)試儀器，以確保格柵地板有電流刺激，擴音器有聲音刺激，并分別記錄電流強度和聲音強度（分貝）。

2．將大鼠放入條件恐懼箱2min（A相），記錄這最初2min內(nèi)動物的凝滯（freezing）時間作基線。

3．接著加入卡嗒聲，80Db,30s(B相)。

4．緊接著再給予電擊，0.35mA，2s（C相），完成一輪訓(xùn)練。如需要多輪訓(xùn)練，則重復(fù)A、B、C三相訓(xùn)練即可。

5．記錄整個訓(xùn)練階段動物凝滯時間（s），用以測量動物的非條件恐懼（unconditioned fear）。

6．將大鼠移開操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液徹底清潔操作箱，以備進行下一批動物的訓(xùn)練。

（二）測試階段  在訓(xùn)練后的第二天進行，包括關(guān)聯(lián)（context）測試、變更關(guān)聯(lián)（altered context）或條件刺激前（pre-conditioning-stimulus，pre-CS）測試以及條件刺激（conditioning stimulus，CS）測試。測試階段沒有電擊刺激。關(guān)聯(lián)測試和變更關(guān)聯(lián)測試中也沒有聽覺條件刺激，但每只動物所用的操作箱應(yīng)與訓(xùn)練階段的相同。

1．關(guān)聯(lián)測試  將動物放入箱內(nèi)，計算機自動記錄動物的凝滯行為。若用人工觀察，則觀察者（應(yīng)不知道動物的處理或基因型）用靜聲秒表通過箱門上的貓眼（小窗口）觀察動物的行為并計分：凝滯為1分，活動（moving）為0分（也有只記錄凝滯時間）。每10秒觀察一次，共5min，這樣可記錄到30次（bout）可能的凝滯（即最大凝滯得分為30分）。用在這一階段記錄到的、動物在同一操作箱內(nèi)的凝滯時間測量動物的關(guān)聯(lián)條件恐懼（contextually conditioned fear）。此為關(guān)聯(lián)測試。觀察結(jié)束后將動物放回籠內(nèi)，清潔操作箱，進行下一只動物的觀察。

2．變更關(guān)聯(lián)測試和聽覺條件刺激測試  關(guān)聯(lián)測試1h后進行。操作如下：

（1）將計算機調(diào)至所需程序。

（2）操作箱進行如下改造：1用平滑塑料板取代關(guān)聯(lián)條件箱內(nèi)的格柵地板；2在箱的對角線加一塊有色塑料板，這樣將長方體的操作箱變成三角體；3改變嗅覺暗示（olfactory cues）。例如，可在箱的一角放一個裝有一滴桔子汁或檸檬汁的杯子，或直接將一滴果汁涂于墻上。然后開始變更關(guān)聯(lián)和聽覺條件刺激實驗。

（3）將動物放入經(jīng)改造后的關(guān)聯(lián)箱（從關(guān)聯(lián)實驗中的第一只動物開始）。

（4）啟動預(yù)置的實驗程序，每隔10秒記錄動物的凝滯和非凝滯得分（分別為1和0分），共記錄3min，即18次可能的凝滯記錄（凝滯得分為18）。

（5）加入聽覺條件刺激30秒。重復(fù)上述記錄3分鐘。

（6）將動物放回籠子，清潔操作箱，進行下一只動物的測試。

 

因為不同類型的學(xué)習(xí)凝滯時間不同，所以最常使用百分計：

關(guān)聯(lián)=（關(guān)聯(lián)測試中的凝滯得分/30）_*100%

變更關(guān)聯(lián)（條件刺激前）=（變更關(guān)聯(lián)中的凝滯得分/18）_*100%

聽覺暗示（條件刺激）=（聽覺條件刺激中凝滯得分/18）_*100%

對每一不同的凝滯測試計分進行重復(fù)測量單因素方差分析（ANOVA），從此比較關(guān)聯(lián)和變更關(guān)聯(lián)或聽覺暗示之間的條件恐懼程度，并確定組間差異。一般而言，動物在聽覺暗示中的凝滯行為要比關(guān)聯(lián)測試的多。在變更關(guān)聯(lián)測試中，由于關(guān)聯(lián)條件箱已被改造得“面目全非”，訓(xùn)練時動物獲得的對周圍環(huán)境的關(guān)聯(lián)幾乎不存在，因此，凝滯行為應(yīng)該最少。關(guān)聯(lián)與變更關(guān)聯(lián)差別很大，凝滯計分差別越大。

  如果動物在第二天的關(guān)聯(lián)測試和聽覺暗示測試中出現(xiàn)凝滯，而在變更關(guān)聯(lián)測試中不表現(xiàn)凝滯行為，則可認定：動物的感覺和運動功能均正常；能記住前一天與厭惡刺激配對出現(xiàn)的暗示信號；能分辨前一天不與厭惡刺激配對出現(xiàn)的暗示信號，說明動物具有正常的記憶。這些測試中的任何一項增強或減弱，提示調(diào)節(jié)記憶情感部分的神經(jīng)解剖、神經(jīng)遞質(zhì)和基因可能發(fā)生變化。

 

1．動物對電擊的反應(yīng)部分地取決于非條件刺激的電擊強度和痛#。當(dāng)動物（尤其是基因改變的動物，如轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠）不能學(xué)會關(guān)聯(lián)條件反射時，可能是電擊強度不夠或痛#偏高所致。對條件反應(yīng)程度與電擊強度進行比較分析，可排除對電擊強度因素的疑慮；對刺激電流強度（0.1~0.7mA）與反應(yīng)作一“量-效曲線”，可評價動物的痛#或?qū)﹄姄舻拿舾行�。此外，格柵地板若沾有動物的排泄物也可改變電刺激強度。因此，�?yīng)保持格柵地板的清潔與干燥。

2．由于老年動物聽力減弱甚至喪失，對聽覺暗示可能反應(yīng)遲鈍或無反應(yīng)。此外，有些品系的小鼠，即使在成年早期，對高頻音刺激的反應(yīng)尤其減弱。因此，用這一模型測定老年動物或某些品系的小鼠時應(yīng)特別謹慎，并避免用高頻音刺激。

3．要使動物在關(guān)聯(lián)測試中表現(xiàn)凝滯行為，必須讓其在操作箱內(nèi)有適當(dāng)?shù)臅r間。應(yīng)避免將動物放入箱內(nèi)便立即給予電刺激，因為這樣動物沒有時間在電擊與箱內(nèi)環(huán)境（關(guān)聯(lián)）之間形成聯(lián)系。

4．觀察者必須快速、準確地判定動物是否表現(xiàn)凝滯行為，而不應(yīng)在整個10s觀察期間死盯著動物，以免動物在這10s間隙活動而導(dǎo)致計分不準。不同觀察者應(yīng)用同一種方法計分，兩名觀察者計分之間的相關(guān)系數(shù)應(yīng)在0.98以上。同樣地，當(dāng)采用自動計分系統(tǒng)進行計分時，應(yīng)對系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)，使之與人工方法計分相比，兩者的相關(guān)系數(shù)在0.98~1之間。

5．在本實驗中，先測試關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)，再測試暗示條件反應(yīng)。在關(guān)聯(lián)測試中沒有聽覺暗示刺激，因此，動物在暗示條件測試時對聽覺刺激的反應(yīng)有可能發(fā)生消退（extinction）。理論上，這種聽覺暗示反應(yīng)可能減弱。為消除這種實驗偏差，將其中一半動物先測試聽覺暗示反應(yīng)，一小時后再檢查關(guān)聯(lián)條件反應(yīng)。

6．實驗分兩天進行。訓(xùn)練和測試應(yīng)在每天的同一時間進行。測試（凝滯計分）所花的時間比訓(xùn)練要長的多，因此，同一批訓(xùn)練的動物不宜過多。

7．暗示和關(guān)聯(lián)兩種條件恐懼可表現(xiàn)出發(fā)育差異和基因差異。例如，年齡在18天的大鼠有聽覺條件恐懼，但極少有關(guān)聯(lián)條件恐懼；而到23天時，關(guān)聯(lián)和聽覺暗示條件恐懼都有。有些品系的小鼠（如DBA/2小鼠）只有很弱的關(guān)聯(lián)條件恐懼，但聽覺條件恐懼卻很好。

8．對有些基因型動物，如果預(yù)先讓其短暫適應(yīng)關(guān)聯(lián)條件，關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)會得到改善。一般認為這與海馬功能增強有關(guān)。這種適應(yīng)通常在訓(xùn)練前一天進行，而且時間很短（30~60s）。

9．暗示條件恐懼由側(cè)杏仁核調(diào)節(jié)，而關(guān)聯(lián)條件恐懼由杏仁核和海馬共同介導(dǎo)。毀損這些腦區(qū)可削弱或阻斷暗示與關(guān)聯(lián)恐懼條件反射。

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