免疫組化試驗(yàn)抗體選擇及常用染色方法

一、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)
免疫組織化學(xué)是利用抗原抗體的特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。免疫組織化學(xué)染色技術(shù)不僅有較高的敏感性和特異性，其特點(diǎn)是將形態(tài)學(xué)改變與功能、代謝變化結(jié)合起來，直接在組織切片，細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上定位一些蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)的存在，并可精確到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平，結(jié)合電子計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)或激光掃描共聚集顯微術(shù)等技術(shù)，對(duì)被檢物質(zhì)進(jìn)行定量分析。
免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？
實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。
石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？
石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。
常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。

二、免疫組化實(shí)驗(yàn)用抗體的選擇
1、一抗選擇要點(diǎn)
(1)選擇單克隆還是多克隆抗體。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體，單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一特異抗原決定簇結(jié)合，就象導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)較低；而多克隆抗體特異性稍弱，抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色(可以通過封閉等有所避免)。
(2)種屬來源。一般家兔來源的抗體多是多克隆；而小鼠來源的抗體多是單克隆，但也有另外。這條主要要與后面的二抗來源相匹配。
(3)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)什么種屬的抗原，即species reactivity。這一點(diǎn)很重要，一般說明書上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。
(4)能否做免疫組化。一般一抗說明書都會(huì)注明做WB、IHC、ICC、IF等，建議最好選擇注明的抗體，因?yàn)橐话愣际墙?jīng)過文章證明。
(5)檢測(cè)標(biāo)本類型。用于檢測(cè)石蠟切片還是冰凍切片，一般能做石蠟切片的抗體，可能都可以用來檢測(cè)冰凍切片，但能做冰凍切片的抗體，不一定能檢測(cè)石蠟切片中的抗原。
(6)生產(chǎn)廠家。國(guó)外著名抗體生產(chǎn)商原裝抗體質(zhì)量一般沒問題，尤其是美國(guó)Lifespan公司生產(chǎn)的IHCPlusAntibodies系列抗體，全部經(jīng)過病理組織切片檢測(cè)驗(yàn)證，100%質(zhì)量保證，國(guó)內(nèi)北京西美杰科技有限公司有售，就是價(jià)格有點(diǎn)貴；而國(guó)內(nèi)分裝廠家用的一抗工作液，價(jià)格便宜，但有時(shí)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性稍差，不同批次重復(fù)性較差。
(7)價(jià)格與質(zhì)量的矛盾。我個(gè)人認(rèn)為一抗原裝質(zhì)量可能會(huì)好點(diǎn)，因?yàn)樵S多一抗避免反復(fù)凍融，且在稀釋液中穩(wěn)定性較差(若時(shí)間長(zhǎng))，但價(jià)格較貴。

2、二抗選擇要點(diǎn)
(1)種屬來源。主要根據(jù)一抗種屬來源來決定購(gòu)買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)標(biāo)記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標(biāo)記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標(biāo)記的二抗，以與后面的SP結(jié)合反應(yīng)；而免疫熒光染色就需要購(gòu)買不同熒光素標(biāo)記的二抗，如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。這主要與后面有無(wú)三抗和三抗種類有關(guān)。
(3)選擇IgM還是IgG。一般一抗是IgM，那么二抗就選擇IgM；反之，一抗是IgG，則二抗選擇IgG。
(4)生產(chǎn)廠家。一般SP三步法我們實(shí)驗(yàn)室選擇中杉金橋的二抗染色試劑盒，內(nèi)含有工作液的二抗，故試驗(yàn)中只需摸索一抗的濃度即可，效果還可以；而免疫熒光的二抗我一般選擇Jackson ImmnoResearch公司，效果還不錯(cuò)。

三、免疫組化常用的染色方法有哪些
根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
免疫組織化學(xué)染色方法 IHC染色方法有很多種，按部標(biāo)記物的性質(zhì)可分為熒光法(熒光素標(biāo)記)，酶法(辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶)，免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù)等;按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步，三步或多步法);按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如PAP法和標(biāo)記的葡聚糖聚合物(labeled dextran polymer,LDP)法，以及親和連接，如ABC法、標(biāo)記的鏈親和素-生物素(labeled streptoavidin-biotin ,LSAB)法等，其中LSAB是最常用的使用方法。
影響免疫組化染色質(zhì)量的因素很多，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意組織的取材和固定，選擇質(zhì)量好的商品化抗體，恰當(dāng)?shù)倪x擇和使用封閉和抗原修復(fù)手段，嚴(yán)格的技術(shù)操作和對(duì)照等。由于組織內(nèi)待測(cè)抗原已被分解破壞，或抗原含量過低、或固定劑的使用不當(dāng)及抗體質(zhì)量不佳和稀釋度不當(dāng)?shù)瓤沙霈F(xiàn)假陰性反應(yīng);反之，由于抗體與非待檢抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，或組織對(duì)抗體的非特異性吸附及內(nèi)源性過氧化酶(endogenousperoxidase)沒有被阻斷等還可出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。這些可造成判斷的失誤。