細胞穿膜肽傳遞機理及研究前景

 

德克薩斯A&M大學(xué)（TAMU）Jean-Phillipe Pellois博士研究組的興趣在于理解多肽如何溶解或者跨過生物膜，以及運用這方面的知識開發(fā)能夠使蛋白滲透細胞的試劑。能夠使蛋白滲透到細胞在醫(yī)學(xué)或者細胞生物學(xué)上有很大潛在用途，這樣做最有吸引力的方法包括把蛋白吸附到類似于細胞穿膜肽（CPP）這樣的載體系統(tǒng)上。CPPs是一種攜帶大分子載體運輸?shù)郊毎麅?nèi)的多肽，其原型例子包括一種來源于HIV的多肽TAT(GRKKRRQRRR)。CPP-蛋白偶合物分兩步穿入細胞。首先，CPP-蛋白偶合物通過胞噬作用進入細胞，這些分子位于細胞內(nèi)，但是被捕獲在內(nèi)涵體內(nèi) (Fig 1A)。然后這些分子從內(nèi)涵體釋放出來，CPP-蛋白偶合物逃離內(nèi)涵體并進入細胞的胞質(zhì)空間。

 

關(guān)于內(nèi)涵體釋放蛋白的機制了解不多。而且，該過程效率非常低。這代表了一個主要瓶頸，因為蛋白未從內(nèi)涵體成功逃離將不產(chǎn)生生物反應(yīng)。為了提高效率并且使蛋白能容易地傳遞到細胞，Pellois實驗室正研究幾個促進內(nèi)涵體釋放策略。問題是要使內(nèi)涵體的膜溶解而不引起其它細胞的膜破裂，因為這樣會導(dǎo)致細胞死亡。

 

 

一種溶解內(nèi)涵體而不溶解其它膜的方法包括采用依賴pH值的具有溶解作用的多肽。這是基于內(nèi)涵體腔為酸性(pH 4.5-6.5)，這提供了細胞內(nèi)特殊的化學(xué)環(huán)境。例如，多肽E5(GLFEAIAEFIENGWEGLIEGWYG)是流感HA2融合肽的類似物，該研究組考慮E5能否作為融合物促進重組蛋白的傳遞。他們檢測到在酸性pH下E5質(zhì)子化并結(jié)合到脂質(zhì)雙層。然后，形成孔結(jié)合處足夠大可讓大蛋白通過膜擴散[Ref 1]。為了研究這些多肽在細胞內(nèi)的活動，該研究組采用熒光蛋白E5-TAT-mCherry作為模型，在該系統(tǒng)中，E5用于溶解內(nèi)涵體，TAT用于蛋白內(nèi)噬作用，mCherry提供熒光信號，以便在熒光顯微鏡下觀測。

 

 Pellois研究組發(fā)現(xiàn)，當(dāng)E5-TAT-mCherry同活細胞孵育時，它能夠溶解內(nèi)涵體，但是即使在溶解發(fā)生后，E5使E5-TAT-mCherry仍然與內(nèi)涵體相聯(lián)。一種可能的解釋是，E5仍然不可逆地結(jié)合到內(nèi)涵體膜上，雖然E5導(dǎo)致了內(nèi)涵體溶解，但阻止了蛋白釋放。受這些結(jié)果鼓舞， Pellois研究組還顯示能夠通過與E5-TAT傳遞大分子，這適用于組織培養(yǎng)檢測(Fig 1B) [Ref 2]。E5-TAT能夠使細胞吸入其周圍含大分子的培養(yǎng)基。因此，E5-TAT和共孵育的大分子能夠共同聚集到內(nèi)涵體。一旦內(nèi)涵體酸化，E5-TAT導(dǎo)致了內(nèi)涵體溶解，位于內(nèi)涵體腔的大分子自由逃逸到細胞質(zhì)空間并發(fā)揮其生物功能。

 

 

要改進CPPs內(nèi)涵體溶解活性的想法是創(chuàng)新多價系統(tǒng)來增加在內(nèi)涵體膜上局部濃度。Pellois研究組探索了通過合成多個TAT拷貝(TATn, n = 2, 3, 4, 5 ,6 ) 的分支狀分子的方法[Ref 3]。類似于TAT，TAT2進入內(nèi)涵體，不能溶解內(nèi)涵體。TAT4、TAT5、TAT6都不能改進大分子傳遞，因為這些化合物結(jié)合到細胞質(zhì)膜上不活躍。相比之下，TAT3是獨特的，因為，該構(gòu)造能夠溶解內(nèi)涵體并比其它多聚體類似物更有效地把大分子傳遞到細胞質(zhì)膜(Fig 1C)。目前，他們正研究TAT3在分子水平上能否使內(nèi)涵體膜溶解以及TAT自身如何行使其自身功能的。

 

 

用溶解內(nèi)涵體的第三個有吸引力的方法用可見光激發(fā)內(nèi)涵體里存在的TAT熒光復(fù)合物。Pellois研究組證明用TMR（tetramethylrhodamine，四甲基羅丹明）標(biāo)記TAT的TMR-TAT在照射后幾秒內(nèi)能夠溶解內(nèi)涵體(Fig 2)。該作用是根據(jù)一旦激發(fā)TMR，膜上就產(chǎn)生活性單個游離重態(tài)氧分子[Ref 4]。他們的模型是多肽把附近的熒光素帶到膜上，雖然熒光素當(dāng)時不產(chǎn)生單個游離態(tài)氧，但是它局部導(dǎo)致膜組分輕易破壞。該方法是有趣的，因為它可能產(chǎn)生了一種方法學(xué)，研究者可采用該方法對傳遞事件在時間和空間上進行控制，允許他們實時研究某個既定分子在胞內(nèi)濃度突然增加的作用。

 

 

 

許多問題仍需要解決：這些試劑在分子水平上是如何溶解膜的？在胞吞途經(jīng)運輸時被傳遞的大分子降解嗎？溶解內(nèi)涵體的生理作用是什么？解決這些問題來使內(nèi)涵體溶解試劑活性達到最優(yōu)傳遞條件。Pellois研究組目前也試驗他們的方法用于對把轉(zhuǎn)錄因子傳遞到細胞內(nèi)�，F(xiàn)在的目標(biāo)是重新編程和操作人類細胞以獲得組織修復(fù)。最后，他們正采用從內(nèi)涵體裂解獲得教訓(xùn)來開發(fā)能有效裂解細菌膜的多肽試劑。這一方面，目的是學(xué)會如何殺死細菌而不殺死人的健康細胞。

 

1. Lee, Y. J.; Johnson, G.; Pellois, J. P. Biochemistry 2010, 49, 7854.

2. Lee, Y. J.; Erazo-Oliveras, A.; Pellois, J. P. Chembiochem 2010, 11, 325.

3. Angeles-Boza, A. M.; Erazo-Oliveras, A.; Lee, Y. J.; Pellois, J. P. Bioconjug Chem 2010, 21, 2164.

4. Srinivasan, D.; Muthukrishnan, N.; Johnson, G. A.; Erazo-Oliveras, A.; Lim, J.; Simanek, E. E.; Pellois, J. P. PLoS ONE 2011, 6, e17732.